Wir danken Mike W. Davidson (Florida State University) für die Bereitstellung von Plasmid-DNA, die fluoreszierende Proteine. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewähren GM72048 (zum DWP) unterstützt.

1. Vorbereitung des fluoreszierenden Proteins Tropfen Proben Ein fluoreszierendes Protein Tröpfchen Probe besteht aus einem 1-octanol/water Emulsion mit dem fluoreszierenden Protein mit Wohnsitz in der wässrigen Phase. Diese Emulsion wird zwischen einen Objektträger und ein 22 mm ² Deckglas für Mikroskopie-Anwendungen eingebettet. <ol><li> Bevor fluoreszierendes Protein Tropfen Proben der Objektträger und Deckgläser müssen gereinigt und mit einem hydrophoben Mittel beschichtet werden. </li><li> Saubere Gläser durch Waschen 5 Minuten mit Aceton und zu verlassen, um von der Luft trocknen. (Optional kann nach der Reinigung der Gläser kann für 30 Sekunden in ein Plasma-Reiniger behandelt werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen Beschichtung). </li><li> Bereiten Sie eine 2% Methyltrimethoxysilan Lösung in Aceton und Beschichtung der Gläser während einer 2-Minuten Inkubation in dieser Lösung. Nach der Beschichtung entfernen Sie die Glaswaren aus der Lösung und lassen Sie von der Luft trocknen. Dann mit 70% Ethanol spülen aus einer Sprühflasche und verlassen, um wieder trocken. (Optional an dieser Stelle die Gläser können für 1 Stunde bei 80 ° C gebacken werden, um kovalent verbinden die Beschichtung auf dem Glas). Beschichtete Gläser können für mindestens einen Monat gelagert werden. </li><li> Fluoreszierende Proteine ​​sind als His 6-markierte Protein aus E. gereinigt Coli 1. Messen Sie das Absorptionsspektrum des gereinigten Proteins und bereiten ein Lager Verdünnung mit einer optischen Dichte von ~ 0,1 in STE-Puffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA), mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) . Darüber hinaus bereiten 10 ml eines 1:1-Gemisches von 1-Octanol und STE-Puffer in einem 15 ml konischen Rohr und kräftig schütteln. Nach dem Mischen zu verlassen, bis die Phasentrennung abgeschlossen ist. Die obere Phase ist die 1-Octanol. (Achtung: Da 1-Octanol hat einen starken Geruch ist es wichtig, einen geschlossenen Abfallbehälter für alles, was in Kontakt mit 1-Octanol ist, benutzt.) </li><li> Um die Emulsion Pipette 45 ul 1-Octanol und 5 ul fluoreszierendes Protein in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Tippen Sie auf die Tube ein paar Mal mit dem Finger, um die Bildung der Emulsion zu starten und dann beschallen das Röhrchen für 30 Sekunden in einem Ultraschallbad. In der Zwischenzeit erhalten eine beschichtete Objektträger und Deckglas bereit. Nach der Beschallung der Emulsion sollte vollständig bedeckt. Unmittelbar nach Beschallung Pipette 4 ul-Emulsion aus der Mitte der Röhre auf einen beschichteten Objektträger und decken mit einer beschichteten Deckglas. </li><li> Wenn das Verfahren richtig gemacht die Emulsion gleichmäßig verteilt zwischen dem Objektträger und dem Objekt Glas. Innerhalb weniger Minuten die Probe sollte stabil sein, bestehend aus ca. 10 mu m dicke Leuchtstoff Tröpfchen mit unterschiedlichem Durchmesser. Die größten Tropfen werden in der Nähe der Mitte der Probe und die kleineren sind weitere zu den Rändern hin gelegen. </li></ol> 2. Einrichten einer Photokonversion Experiment Das folgende Verfahren ist eine allgemeine Strategie für den Aufbau eines fluoreszierenden Proteins Photokonversion Experiment. Dieses Verfahren kann für gereinigte Proteine ​​als auch für lebende Zellen angewendet werden. <ol><li> Die folgenden Parameter stellen einen allgemeinen Ausgangspunkt, um Ihre Photokonversion Experiment: 40x 1.3NA Ölimmersionsobjektiv Bildgröße = 512 x 512 Pixel Scan-Zoom = 4 Pixelverweilzeit = 6 us. Z-Auflösung (Pinholegröße) = 3 um </li><li> Konfigurieren Sie zwei Detektionskanäle für die Anfangs-und photokonvertiertem Fluoreszenz, sowie eine &quot;Photokonversion Kanal&quot;. In diesem Beispiel verwenden wir gereinigt mOrange2 Protein, das einen orange-to-rot Photokonvertierbare fluoreszierenden Proteins ist. Die orange Spezies erkannt wird mit 561 nm Anregungs-und die Fluoreszenz zwischen 570 nm und 630 nm gesammelt. Die photokonvertiertem roten Spezies erkannt wird mit 633 nm Anregungs-und die Fluoreszenz zwischen 640 nm und 700 nm gesammelt. Für die &quot;Photokonversion channel&quot; wählen 488 nm Anregungs-und Fluoreszenz sammeln zwischen 490 nm und 540 nm. (Hinweis:. Bildgebung der Photokonversion Kanal ist nicht unbedingt notwendig) </li><li> Verwenden Sie den Kanal für die Bildgebung der ersten Fluoreszenz mit kontinuierliche Abtastung der Laserleistung und Detektor Gewinn für optimale Bildqualität anzupassen. </li><li> Aktivieren Sie die Photokonversion Kanal und wählen Sie eine niedrige Laserleistung. Starten Bildgebung einer Zeitserie und schrittweise Erhöhung der Photokonversion Laser, bis signifikante Ausbleichen der anfängliche Fluoreszenz beobachtet wird. Setzen Sie den Scanvorgang, bis die anfängliche Fluoreszenz beträgt ca. 75% gebleicht. </li><li> Deaktivieren Sie die Photokonversion Kanal und aktivieren Sie die Erkennung Kanal für die photokonvertiertem Fluoreszenz. Starten Bildgebung mit hoher Detektor zu gewinnen und niedrige Laserleistung und schrittweise Erhöhung der Laserleistung, bis die photokonvertiertem Fluoreszenz detektiert. Sobald Sie erkennen die photokonvertiertem Fluoreszenz Sie Laserleistung und Detektor zu gewinnen für eine optimale Bildqualität einstellen können. </li><li> Schließlich verwendet die Laserleistungfür Photokonversion sowie die Dauer der Photokonversion müssen optimiert werden. Die Erhöhung der Photokonversion Laserleistung beschleunigt die Rate der Photokonversion jedoch zu viel Laserleistung wird das Protein photobleach. </li><li> Sobald die optimale Photokonversion Laserleistung und die Dauer bestimmt worden sind, können diese Parameter verwendet, um ein Standard-Bleichen oder FRAP-Modul und dem &quot;Photokonversion Kanal&quot; ist nicht mehr erforderlich zu konfigurieren. </li></ol> 3. Dual-Sonde optische Hervorhebung mit mOrange2 und Dronpa Aufgrund der Rotverschiebung spektralen Eigenschaften können mOrange2 in Kombination mit dem grünen photoschaltbare fluoreszierendes Protein Dronpa für Dual-Sonde optische Hervorhebung verwendet werden, um eine selektive Hervorhebung von 4 einzelnen Zelle (Organellen) Populationen zu ermöglichen. <ol><li> Die Zellen werden in Glasboden MatTek Gerichte gewachsen und transfizierten 24 Stunden vor der Bildgebung unter Verwendung von Standard Lipofectamine2000 Transfektion 1. </li><li> Richten Sie das Mikroskop für mOrange2 Photokonversion wie in Abschnitt 2 beschrieben. </li><li> Konfigurieren Sie das Mikroskop für Dronpa Photoschaltung. Dronpa Fluoreszenz abgebildet mit den mOrange2 &quot;Photokonversion channel&quot; (siehe Schritt 2.2). (Hinweis: Minimieren Sie die Laserleistung für die Bildgebung verwendet Dronpa, weil zu viel Laserleistung Inaktivierung von Dronpa verursachen.) Hinzufügen eines Kanals für Dronpa Photoaktivierung. Wir verwenden 800 nm Zwei-Photonen-Anregung für Photoaktivierung, sondern alternativ kann dies erreicht mit 405 nm Anregung sein. Bestimmen Sie die Laserleistung für die Bildgebung erforderlich, Photoaktivierung und Photoinaktivierung Dronpa Fluoreszenz. </li><li> Achtung: Photokonversion mOrange2 und Inaktivierung von Dronpa sowohl bei 488 nm Anregung auftreten. Aufgrund der hohen Laserleistung für mOrange2 Photokonversion benötigt wird dies auch inaktivieren Dronpa Fluoreszenz. Auf der anderen Seite tritt Dronpa Inaktivierung bereits bei viel geringerer Laserleistung und kann ohne nennenswerte mOrange2 Photokonversion durchgeführt werden. </li><li> Nachdem die Parameter für mOrange2 Photokonvertierung und Dronpa Photoschaltung gesetzt sind, ist dual-Sonde optische Hervorhebung durch die folgenden Schritte erreicht. Zunächst inaktivieren Dronpa Fluoreszenz in der gesamten Sichtfeld mit Low-Power 488 nm Anregung. Zweitens, wählen Sie eine Region von Interesse und photoconvert mOrange2 mit hoher Leistung 488 nm Anregung. Schließlich wählen Sie eine Region von Interesse Dronpa Fluoreszenz zu aktivieren. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Droplet Probenvorbereitung. A) richtig vorbereitet Tropfen Probe. B) Muster ohne Beschichtung der Objektträger und Deckglas vorbereitet. C) Probe ohne Zugabe von 0,1% BSA vorbereitet. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Wirkung von Photokonversion Laserleistung und die Dauer auf mOrange2 Photokonversion. Einzel Tröpfchen mit mOrange2 Protein wurden kontinuierlich photokonvertiertem mit unterschiedlichen Mengen von 488 nm Laserleistung. Relative Laserleistung für Photokonversion betrug 10% (massiv), 25% (gestrichelt) und 100% (gepunktet). A) Orange fluoreszierende Spezies. B) photokonvertiertem rot fluoreszierende Spezies. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Dual-Sonde optische Hervorhebung mit mOrange2 und Dronpa. A) exprimiert mOrange2-Histone H2B und Dronpa-Mito vor Photokonversion, zeigt orangefarbene Fluoreszenz in den Zellkern und grüne Fluoreszenz in den Mitochondrien. B) Dronpa Fluoreszenz wurde mit Low-Power 488 nm Anregung eingeschaltet, wodurch minimale Photokonversion mOrange2. C) mOrange2 war rot mit hoher Leistung 488 nm Anregung photokonvertiertem. D) Dronpa Fluoreszenz wurde wieder mit 800 nm 2-Photonen-Anregung eingeschaltet. Die Paneele sind Überlagerungen der Fluoreszenzbilder zusammen mit dem Differential-Interferenz-Kontrast Bild.

<ol>
	<li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 6, 355-358 (2009).</li></ol>

Das gereinigte fluoreszierendes Protein Tröpfchen Probe ist eine sehr bequeme Sample-Format für die photophysikalische Charakterisierung von fluoreszierenden Proteinen, zum Beispiel zu studieren photobleaching Kinetik und Photokonversion Kinetik. Die extrem kleinen Tröpfchen Volumen (~ 20 Picoliter) erleichtert Bleichen und Photokonversion Experimente, die schwierig sein, in Küvette basierten Systemen ausgeführt werden können. Darüber hinaus, da hier die Tröpfchen Probe ist ideal für den Aufbau eines konfokalen...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microsope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>48312-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22 mm cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940-245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-octanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>methyltrimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MatTek dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-019</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells

Photokonvertierbare fluoreszierende Proteine ​​(pc-FPs) sind eine Klasse von fluoreszierenden Proteinen mit &quot;optischen Hervorheben&quot;-Funktion, was bedeutet, dass die Farbe der Fluoreszenz durch Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge verändert werden kann. Optische Hervorhebung ermöglicht nicht-invasive Kennzeichnung einer Subpopulation von fluoreszierenden Molekülen, und ist daher ideal für die Verfolgung von einzelnen Zellen oder Organellen. Kritische Parameter für eine effiziente Photokonversion sind die Intensität und die Belichtungszeit der Photokonversion Licht. Wenn die Intensität zu niedrig ist, wird Photokonversion werden langsam oder gar nicht vorzukommen. Auf der anderen Seite kann zu viel Intensität oder zu lange Exposition photobleach des Proteins und somit die Verringerung der Effizienz des Photokonversion. Dieses Protokoll beschreibt einen allgemeinen Ansatz zur Einrichtung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop für PC-FP Photokonversion Anwendungen. Zunächst beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung gereinigtes Protein Tropfen Proben. Diese Sample-Format ist sehr praktisch für das Studium der photophysikalische Verhalten von fluoreszierenden Proteinen unter dem Mikroskop. Zweitens verwenden wir das Protein Tröpfchen Probe, um zu zeigen, wie man das Mikroskop für Photokonversion konfigurieren. Und schließlich werden wir zeigen, wie optische Hervorhebung in lebenden Zellen, einschließlich Dual-Sonde optische Hervorhebung mit mOrange2 und Dronpa durchzuführen.

Watch this Scientific Journal Video about Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells at JoVE.com

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Dieses Protokoll beschreibt einen allgemeinen Ansatz zur Photokonversion von fluoreszierenden Proteinen auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt. Wir beschreiben Verfahren für die Photokonversion puried Protein-Proben, sowie für Dual-Sonde optische Hervorhebung in lebende Zellen mit mOrange2 und Dronpa.

Photokonversion von gereinigtem fluoreszierende Proteine ​​und Dual-Sonde Optische Hervorhebung in lebenden Zellen

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

photoconversion-purified-fluorescent-proteins-dual-probe-optical

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Aufrufe.  Vanderbilt University. Dieses Protokoll beschreibt einen allgemeinen Ansatz zur Photokonversion von fluoreszierenden Proteinen auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt. Wir beschreiben Verfahren für die Photokonversion puried Protein-Proben, sowie für Dual-Sonde optische Hervorhebung in lebende Zellen mit mOrange2 und Dronpa.

Serie: Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Forschung

Biologie

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Richtige Pflege und Reinigung des Mikroskops

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Polarized Translokation von fluoreszierenden Proteinen in Xenopus Ektoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Charakterisierung von Verkalkungen Events Verwendung von Live-optische und Elektronenmikroskopie-Techniken in einem Marine-Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Photokonversion von gereinigtem fluoreszierende Proteine und Dual-Sonde Optische Hervorhebung in lebenden Zellen

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Richtige Pflege und Reinigung des Mikroskops

Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

Polarized Translokation von fluoreszierenden Proteinen in Xenopus Ektoderm in Response to Wnt Signaling

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine in

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

Charakterisierung von Verkalkungen Events Verwendung von Live-optische und Elektronenmikroskopie-Techniken in einem Marine-Tubeworm

Photokonversion von gereinigtem fluoreszierende Proteine ​​und Dual-Sonde Optische Hervorhebung in lebenden Zellen

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Richtige Pflege und Reinigung des Mikroskops

Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

Polarized Translokation von fluoreszierenden Proteinen in Xenopus Ektoderm in Response to Wnt Signaling

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

Charakterisierung von Verkalkungen Events Verwendung von Live-optische und Elektronenmikroskopie-Techniken in einem Marine-Tubeworm

Photokonversion von gereinigtem fluoreszierende Proteine und Dual-Sonde Optische Hervorhebung in lebenden Zellen

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine in

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte