Nehmen Sie zunächst die DNA-Fragmente der knappen Zelle, die mit Biotin gezogen wurden. Bereiten Sie eine Mastermischung vor, indem Sie die Reagenzien für das dATP-Tailing hinzufügen und die Probe 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend wird Klenow exo-minus inaktiviert, indem die Probe 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius inkubiert und auf Eis abgekühlt wird.
Nachdem Sie die Kügelchen mit je 300 Mikrolitern TB, NTB und 100 Mikrolitern Ligationspuffer gewaschen haben, resuspendieren Sie sie in 50 Mikrolitern Ligationspuffer. Fügen Sie der Probe vier Mikroliter 15 Mikromolare vorgeglühte Adaptermischung und einen Mikroliter 2000 Einheiten pro Mikroliter T4-DNA-Ligase hinzu. Waschen Sie die Perlen mit 400 Mikrolitern TB, 200 Mikrolitern NTB und 100 Mikrolitern Restriktionspuffer zwei.
Nach der Amplifikation der Bibliothek durch PCR werden alle 50 Mikroliter-Reaktionen aus derselben Probe in einem 1,5-Milliliter-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung zusammengefasst. Legen Sie es auf einen Röhrenmagneten und warten Sie, bis alle Perlen an der Wand kleben. Übertragen Sie den Überstand, der die Bibliothek enthält, in ein neues 1,5-Milliliter-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung und füllen Sie ihn mit TLE-Puffer auf 500 Mikroliter auf.
Um eine doppelseitige Auswahl mit paramagnetischer Perlenreinigung durchzuführen, geben Sie 200 Mikroliter Brühperlen in die Bibliothek, mischen Sie sie durch Wirbeln und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang, wobei Sie sie bei Raumtemperatur drehen. Legen Sie dann die Bibliothek auf einen Magneten und warten Sie, bis alle Perlen an der Wand kleben. Übertragen Sie den Überstand, der die Bibliothek enthält, in ein neues 1,5-Milliliter-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung.
Konzentrieren Sie die Perlen, indem Sie 750 Mikroliter Brühperlen nehmen und sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen auf einen Magneten legen. Sobald alle Perlen an der Wand kleben, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Perlen erneut, indem Sie 300 Mikroliter neue Schaftperlen einwerfen. Fügen Sie der Probe 300 Mikroliter konzentrierte Kügelchen hinzu.
Durch Vortexen mischen und 10 Minuten unter Rotation bei Raumtemperatur inkubieren. Auf einen Magneten legen. Warten Sie, bis alle Perlen an der Wand kleben, und entfernen Sie den Überstand.
Waschen Sie die Perlen, indem Sie einen Milliliter 70%iges Ethanol in das Röhrchen geben, während sich die Perlen noch auf dem Magneten befinden. Lassen Sie die Perlen an der Luft trocknen und resuspendieren Sie sie in 21 Mikrolitern TLE-Puffer durch Vortexen. Um die Bibliothek aus den Beads zu eluieren, inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Thermoblock.
Legen Sie das Röhrchen in einen Magneten und übertragen Sie den Überstand mit der Bibliothek in ein neues 1,5-Milliliter-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung.
