Cyber-Generierung ist immer noch das State-of-the-Art-Protokoll, um die pathogene Rolle jeder neuartigen mitochondrialen DNA-Mutation zu verstehen und den Prozentsatz der Atriplassie mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren. Diese Technik ermöglicht die Durchführung biochemischer Untersuchungen in einem homogenen Kernsystem, in dem der Beitrag des nuklearen Hintergrunds des Patienten fehlt. Diese Technik ermöglicht die Validierung der Pathogenität einer Mutation der mitochondrialen DNA.
und ermöglicht es, seine Auswirkungen auf biochemischer Ebene zu untersuchen Waschen Sie das 35-Millimeter-Geschirr, das die Fibroblasten enthält, zweimal mit zwei Millilitern 1X PBS ohne Kalzium und Magnesium. Reinigen Sie die äußere Oberfläche des Geschirrs mit 70% Ethanol und warten Sie, bis der Alkohol verdunstet. Entfernen Sie die Deckel vom Geschirr und die Schraubverschlüsse von den Flaschen.
Stellen Sie jede Schale ohne Deckel kopfüber auf den Boden jeder 250-Milliliter-Zentrifugenflasche. Fügen Sie langsam 32 Milliliter eines Keimbildungsmediums zu jeder Flasche hinzu, damit das Medium in die Schale gelangen und mit den Zellen in Kontakt kommen kann. Entfernen Sie alle Blasen vom Geschirr mit einer langen Glaspipette und krümmen Sie die Spitze in einer Bunsenflamme.
Schließen Sie jede Flasche mit dem Schraubverschluss und geben Sie sie in die Zentrifuge. Zentrifen Sie für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 8.000 x G.Saugen Sie das Medium aus den Flaschen und entsorgen Sie es. Entfernen Sie das Geschirr, indem Sie die Flaschen auf einer sterilen Gaze umdrehen, die zuvor mit 70% Ethanol besprüht wurde.
Reinigen Sie die äußere Oberfläche des Geschirrs und seiner Deckel mit 70% Ethanol und schließen Sie das Geschirr, nachdem das Ethanol verdunstet ist. Bevor Sie fortfahren, überprüfen Sie die Cytoplastenbildung mit einem inversen Mikroskop für lebende Zellen. Suchen Sie nach extrem länglichen Fibroblasten aufgrund der Extrusion ihrer Kerne, die durch Cytochalasin induziert werden.
Fügen Sie zu jeder 35-Millimeter-Schale 1.000, 143 Zeilennullzellen hinzu. Resuspendiert in zwei Millilitern Kulturmedium, ergänzt mit 5% FBS. Lassen Sie das Geschirr drei Stunden in einem befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator, um die 143 Reihen-Null-Zellen auf den Geistern zu besiedeln.
Nach drei Stunden Inkubation das Medium absaugen und entsorgen. Waschen Sie die Adhärenzzellen zweimal mit zwei Millilitern DMEM-hohem Glukosemedium ohne Serum oder MEM, dann aspirieren und verwerfen Sie das Medium. Geben Sie 500 Mikroliter Polyethylenglykollösung in die Zellen und inkubieren Sie für genau eine Minute.
Saugen Sie die Polyethylenglykollösung ab und verwerfen Sie sie. Waschen Sie die Zellen dreimal mit zwei Millilitern DMEM-hoher Glukose ohne Serum oder mit MEM. Fügen Sie zwei Milliliter Fusionsmedium hinzu und inkubieren Sie über Nacht im Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Trypsinisieren Sie die Zellen in den verbleibenden Kulturschalen Zählen Sie sie und säen Sie sie in eine oder mehrere Petrischalen Fügen Sie 50 bis 100 Zellen pro Schale in die ergänzte Kultur ein, bis Klone erscheinen. Dann lassen Sie sie mehrere Tage wachsen. Nehmen Sie mit einem Stereomikroskop die Klone mit Klonflaschen oder einer Pipettenspitze aus der Petrischale auf.
Versuchen Sie, das Pooling verschiedener Klone zu vermeiden und übertragen Sie sie auf eine 96-Well-Platte, die jeweils 200 Mikroliter ergänztes Kulturmedium enthält. Cybrids wurden ausgehend von Fibroblasten erzeugt, die von einem Patienten abgeleitet wurden, der den heteroplasmatischen M2343A2G trug Eine der häufigsten mitochondrialen DNA-Mutationen, die mit mitochondrialer Myopathie, Enzephalopathie, Laktatazidose und Schlaganfall-ähnlichen Episoden assoziiert sind. Die Analyse einer variablen Anzahl von Tandemwiederholungen zeigte, dass Cyber-DNA mit den Zellen der Reihe Null identisch ist, was den Ersatz der Cyber-DNA des Patienten durch das 143 B-Genom bestätigt.
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus oder Sequenzierungsanalysen können verwendet werden, um das Vorhandensein der mitochondrialen DNA-Mutation und den Heteroplasmieprozentsatz zu beurteilen. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, das korrekte genetische Asset des Nukleons und der mitochondrialen DNA sowie die mitochondriale DNA-Menge in den wiederbesiedelten Cybriden zu überprüfen.
