1988 startete Richard Lenski ein Evolutionsexperiment. Er füllte 12 Erlenmeyerkolben mit einem glukosebegrenzten definierten Wachstumsmedium, das als DM25 bekannt ist. Er impfte sechs dieser Flaschen mit einem E.coli-Stamm namens REL606, der den Zucker Arabinose nicht als Nährstoff verwerten kann.
Diese Populationen wurden als A-1 bis A-6 bezeichnet. Er impfte die anderen sechs mit einem nahezu identischen Stamm namens REL607, der Arabinose verwenden kann. Diese Urstämme, die E. coli, die sich aus ihnen entwickelt haben, können unterschieden werden, wenn sie auf Tetrazolium oder Arabinose-Agar plattiert werden.
Die Ara-Stämme bilden rote Kolonien und die Ara+-Stämme weiße Kolonien. Lenski stellte diese Flaschen in einen Schüttelbrutschrank bei 37 Grad Celsius, damit sie bis zur Sättigung wachsen und die Glukose im Medium erschöpfen konnten. Zu diesem Zeitpunkt übertrug er 1 % der Kultur aus jedem der Fläschchen in einen neuen Satz von 12 Fläschchen, die frisches Medium enthielten.
Diese täglichen Zyklen von Transfer und Nachwachsen werden seit Jahrzehnten fortgesetzt und haben eine lange Evolutionsgeschichte geschaffen, die von Forschern untersucht werden kann. In unserem Protokoll beschreiben wir, wie die LTEE-Populationen (Long Term Evolution Experiment) jeden Tag übertragen und kultiviert werden. Dann beschreiben wir, wie die Populationen regelmäßig auf mögliche Anzeichen einer Kontamination untersucht und archiviert werden, um eine dauerhafte gefrorene Aufzeichnung für spätere Studien zu erhalten.
Wir bezeichnen dies oft als den, Zitat, Fossilbericht des LTEE. Eine wichtige Möglichkeit, das Gesamttempo und den Charakter evolutionärer Veränderungen im LTEE zu überwachen, ist die Messung der relativen Fitness von Populationen und Stämmen aus dem Experiment. Wir beschreiben, wie diese Co-Culture-Wettbewerbsassays durchgeführt werden und analysieren die resultierenden Daten, um relative Fitnesswerte zu berechnen.
In diesem Video zeigen wir das erste und das letzte dieser Verfahren. Zuerst werden wir einen täglichen Transfer des Langzeit-Evolutionsexperiments demonstrieren. Desinfizieren Sie die Oberfläche, auf der die LTEE-Übertragungen durchgeführt werden, indem Sie sie entweder mit 70%Ethanol oder einer 10%igen Bleichlösung abwischen.
Zünden Sie einen Bunsenbrenner an, um einen lokalen Aufwind zu erzeugen und das Abflammen von Glaswaren zu ermöglichen. Bereiten Sie 13 50-Milliliter-Pyrex-Erlenmeyerkolben vor, die mit 20-Milliliter-Pyrex- oder Polypropylen-Bechern verschlossen sind, die durch Autoklavieren gewaschen und sterilisiert wurden. Überprüfen Sie die Kolben auf sichtbaren Schmutz und ersetzen Sie diejenigen, die nicht perfekt sauber sind.
Beschriften Sie sechs Flaschen A-1 bis A-6 mit einem roten Marker und die anderen sechs Flaschen A+1 bis A+6 mit einem schwarzen Marker. Beschriften Sie den letzten verbleibenden Kolben, bei dem es sich um den leeren Kolben handelt, mit dem Datum im Monats-Tag-Format und dem Wochentag. Füllen Sie jeden der 13 Flaschen mit einer sterilen serologischen 10-Milliliter-Pipette mit 9,9 Millilitern DM25-Medium.
Entflammen Sie die Öffnung jedes Kolbens, nachdem Sie das als Deckel dienende Becherglas entfernt und das Becherglas wieder eingesetzt haben. Entflammen Sie die Spitze der Pipette zwischen dem Befüllen der einzelnen Kolben. Nehmen Sie die LTEE-Kolben des Vortages aus dem Schüttel-Inkubator.
Untersuchen Sie jeden der Reihe nach, indem Sie ihn gegen das Licht halten, um seine Trübung und Farbe zu beurteilen. Überprüfen Sie die Unversehrtheit des Kolbens und suchen Sie nach Fremdkörpern. Übertragen Sie mit einer P200-Mikropipette mit einer sterilen Filterspitze 100 Mikroliter Kultur aus jeder LTEE-Flasche in den entsprechenden Kolben mit frischem DM25.
Beginnen Sie mit A-1 und übertragen Sie dann A+1. Danach wechseln Sie weiter zwischen den Minus- und Plus-Populationen. Um den Überblick zu behalten, welche Kulturen übertragen wurden, verschieben Sie die Kolben nach links, um von oder zu ihnen zu pipettieren.
Beachten Sie bei den Transfers eine strenge aseptische Technik. Verwenden Sie für jeden Transfer eine frische Pipettenspitze. Entflammen Sie die Mündungen der Kolben unmittelbar nach dem Öffnen und vor dem Umschließen und wischen Sie den Zylinder und den Injektor der Mikropipette zwischen jedem Transfer mit einem mit 70 % Ethanol befeuchteten Kimwipe ab.
Inkubieren Sie die neu beimpften Flaschen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 120 Umdrehungen pro Minute und Orbitalschütteln über einen Durchmesser von einem Zoll. Lagern Sie die Kulturen des Vortages bei vier Grad Celsius. Bewahren Sie diese Kulturen zwei Tage lang auf.
Entsorgen Sie ältere Kulturen, die drei Tage zuvor bei vier Grad Celsius gerettet wurden, zu diesem Zeitpunkt. Geben Sie die Uhrzeit, das Datum, die Überweisungsnummer, Ihren Namen oder Ihre Initialen, ob die Kulturen in Ordnung waren oder nicht, und alle anderen relevanten Informationen in das Transferprotokoll-Notizbuch ein. Weitere 6 2/3 Generationen sind in der Geschichte des Langzeit-Evolutionsexperiments mit E. coli vergangen.
Wenn es Probleme, Unfälle oder den Verdacht einer Kontamination mit den LTEE-Kulturen des Vortages gibt, übertragen Sie nicht von diesen. Lagern Sie stattdessen den gesamten Satz von 12 Kulturen bei vier Grad Celsius, um ihn später zu untersuchen und weiter zu charakterisieren. Holen Sie die Reserveflaschen, die vom Vortag umgefüllt und bei vier Grad Celsius gelagert wurden.
Legen Sie sie auf die Tischplatte, um sie auf Raumtemperatur zu erwärmen. Schwenken Sie jeden Kolben vorsichtig, um die Zellen wieder zu suspendieren. Übertragen Sie jedes Kolben in ein neues Kolbenset in ein neues Medium und setzen Sie das Experiment normal fort.
Vermerken Sie im Übertragungsprotokoll, dass Sie die Sicherungskulturen verwendet haben, und notieren Sie die gleiche Übertragungsnummer wie am Vortag. Wird in den bei vier Grad Celsius gelagerten Reserveflaschen eine Kontamination festgestellt, müssen die betroffenen LTEE-Populationen aus gefrorenen Beständen wieder in Betrieb genommen werden. Als Nächstes demonstrieren wir einen Co-Culture-Konkurrenz-Assay, mit dem die relative Fitness von zwei Stämmen oder Populationen aus dem Langzeit-Evolutionsexperiment gemessen werden kann.
Wir zeigen ein Wettbewerbsexperiment, das beide LTEE-Vorfahren, REL606 und 607, sowie zwei entwickelte Populationen, Population A-5 mit 20.000 Generationen, REL8597, und Population A+5 mit 20.000 Generationen, REL8604, entwickelt. Diese Assays verwendeten eine sechsfache Replikation für jedes Paar eines Ara- und Ara+-Konkurrenten. Entscheiden Sie, wie viele LTEE-Stämme und/oder Populationen Sie von Mitbewerbern verwenden und wie viele Replikations-Wettbewerbsassays für jedes Mitbewerberpaar durchgeführt werden.
Bereiten Sie die erforderlichen Vorräte wie folgt vor. Füllen Sie für den Wiederbelebungstag, Tag minus zwei, einen sterilen 50-Milliliter-Erlenmeyerkolben, der mit einem 20-Milliliter-Becherglas verschlossen ist, mit 9,9 Millilitern entweder DM1000 oder lysogener Bouillon, LB, pro Stamm oder Population von E. coli, die als Konkurrent verwendet wird. Füllen Sie einen weiteren Kolben mit 9,9 Millilitern desselben Mediums, um als ungeimpfter Rohling zu dienen.
Füllen Sie für den Vorkonditionierungstag, Tag minus eins ein Reagenzglas mit 9,9 Millilitern steriler Kochsalzlösung mit 0,85 % Gewicht pro Volumen, zwei Kolben mit 9,9 Millilitern DM25 pro Replikationstest zwischen zwei Wettbewerbern und einen weiteren Kolben mit 9,9 Millilitern DM25 für einen Blindling. Füllen Sie für den Tag, an dem der Wettbewerb beginnt, Tag Null, einen Kolben mit 9,9 Millilitern DM25, füllen Sie ein Reagenzglas mit 9,9 Millilitern steriler Kochsalzlösung und bereiten Sie eine Tetrazolium- oder Arabinose- oder TA-Platte pro Wettbewerbsassay-Replik vor. Füllen Sie einen weiteren Kolben mit 9,9 Millilitern DM25, der als Rohling dient.
Wenn Sie einen dreitägigen Wettkampf durchführen, füllen Sie zwei zusätzliche Sätze Wettkampfflaschen. Füllen Sie für den letzten Wettkampftag zwei Reagenzgläser mit 9,9 Millilitern steriler Kochsalzlösung und bereiten Sie pro Wettkampfreplikat eine TA-Platte vor. Am zweiten Tag eines Wettbewerbsexperiments beleben Sie die Teilnehmer getrennt von Tiefkühlbeständen.
Nehmen Sie die Kryogefäße, die die gefrorenen Bestände der Konkurrenzstämme enthalten, aus dem 80-Grad-Celsius-Gefrierschrank. Bewahren Sie die Fläschchen während der Verwendung gekühlt in einem schönen Eimer auf. Nachdem jede gefrorene Brühe aufgetaut ist, wirbeln Sie sie gründlich vor, um die E.coli-Zellen wieder zu suspendieren.
Wenn Sie einen Klon wiederbeleben, impfen Sie den Kolben mit frischem Medium mit 12 Mikrolitern der gefrorenen Brühe. Wenn Sie eine Population wiederbeleben, impfen Sie mit 120 Mikrolitern der gefrorenen Brühe. Inkubieren Sie die Wiederbelebungskolben im Rohling bei 37 Grad Celsius über Nacht mit 120 Umdrehungen pro Minute Orbitalschütteln über einen Durchmesser von einem Zoll.
Am Tag minus eins eines Wettbewerbsversuchs bereiten Sie die Teilnehmer separat in DM25 vor. Nehmen Sie die Fläschchen mit den Kulturen wiederbelebter Konkurrenten aus dem Inkubator. Übertragen Sie 100 Mikroliter aus jedem Kolben in das Reagenzglas mit Kochsalzlösung für diesen Teilnehmer.
Jedes Verdünnungsröhrchen gründlich vortexen, bevor 100 Mikroliter aus der verdünnten Kultur in einen Kolben mit frischem DM25 umgefüllt werden. Impfen Sie zwei dieser Vorkonditionierungskolben für jeden Replikatassay, einen für jeden der Wettbewerber. Inkubieren Sie die Vorkonditionierungskolben im Rohling bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden.
Am dritten Tag eines Wettbewerbsexperiments beginnen Sie den Wettbewerb, indem Sie die Teilnehmer mischen und für die ersten Zählungen anlegen. Nehmen Sie die Vorkonditionierungsflaschen aus dem Inkubator. 50 Mikroliter des Ara-Teilnehmers in die erste mit frischem DM25 gefüllte Wiederholungs-Wettkampfkolben füllen.
Geben Sie sofort 50 Mikroliter des Ara+competitor in dieselbe Wettkampfflasche. Mischen Sie den Kolben durch leichtes Schwenken. Wiederholen Sie diese Schritte, um alle Replikate aller getesteten Mitbewerberpaare zu kombinieren.
Übertragen Sie 100 Mikroliter aus jeder neu beimpften Wettkampfflasche in das Reagenzglas mit Kochsalzlösung, das für diese Wettbewerbsassay-Wiederholung markiert ist. Legen Sie die neuen Wettkampfflaschen und den Rohling in den Schüttelbrutkasten. In der Zwischenzeit wird am selben Tag jedes Reagenzglas gründlich vorgewirbelt und 80 Mikroliter dieser 10.000-fachen Verdünnungen auf TA-Platten aufgetragen.
Beschriften Sie die Seite des Bodens jeder Platte mit dem gemischten Sortenpaar, der Wiederholungszahl und dem Tag Null, um anzuzeigen, dass sie verwendet wird, um die anfängliche Repräsentation jedes Konkurrenten zu bestimmen. Inkubieren Sie die TA-Platten kopfüber in einem Schwerkraft-Konvektions-Inkubator bei 37 Grad Celsius, bis die Kolonien der Ara- und Ara+-Konkurrenten sichtbar und unterscheidbar sind. Im Allgemeinen geschieht dies innerhalb von 16 bis 24 Stunden, bei einigen weiterentwickelten Sorten kann es jedoch länger dauern.
Zählen Sie die Anzahl der Ara-roten und Ara+weißen Kolonien auf jeder Platte und notieren Sie die Ergebnisse. Wenn Sie einen dreitägigen Wettkampf durchführen, übertragen Sie 100 Mikroliter von jedem Wettkampf und replizieren Sie ihn nach dem Wachstum auf 9,9 Milliliter frisches DM25-Medium in einem neuen Kolben. Inkubieren Sie diese Day-One-Flaschen 24 Stunden lang.
Führen Sie einen weiteren Transfer auf die gleiche Weise durch und inkubieren Sie die Kolben am zweiten Tag 24 Stunden lang, um drei vollständige Co-Kultur-Wachstumszyklen der Wettbewerber unter LTEE-Bedingungen abzuschließen. Am letzten Tag des Wettbewerbs, am ersten oder dritten Tag, je nach Länge Ihres Experiments, werden Sie die endgültigen Zählungen durchführen. Nehmen Sie die Wettkampfflaschen aus dem Brutkasten.
Übertragen Sie 100 Mikroliter aus jedem Wettkampfkolben in das erste Reagenzglas mit Kochsalzlösung für dieses Replikat. Sprühen Sie jedes 100-fache Verdünnungsröhrchen vor, um es gründlich zu mischen, und übertragen Sie 100 Mikroliter in das zweite Röhrchen mit Kochsalzlösung, um dieses Replikat zu replizieren. Die resultierenden Röhrchen enthalten 10.000-fache Verdünnungen der DM25-Kulturen.
Jedes Reagenzglas mit einer 10.000-fachen Verdünnung gründlich vortexen und 80 Mikroliter davon auf eine TA-Platte geben. Beschriften Sie die Seite des Bodens jeder Platte mit dem gemischten Sortenpaar, der Wiederholungsnummer und dem ersten Tag für einen eintägigen Wettbewerb oder dem dritten Tag für einen dreitägigen Wettbewerb, um anzuzeigen, dass es verwendet wird, um die endgültige Darstellung jedes Teilnehmers zu bestimmen. Inkubieren Sie TA-Platten bei 37 Grad Celsius und zählen Sie die Ara- und Ara+-Kolonien nach dem Wachstum.
Verwenden Sie die Excel-Tabelle, die mit diesem Protokoll geliefert wird, oder das Fitness RR-Paket, um die relative Fitness der Stämme in Ihrem Wettkampf zu berechnen und die Ergebnisse aufzuzeichnen. Während der täglichen Transfers des Langzeit-Evolutionsexperiments ist die Dichte der Kulturen nach dem Wachstum sehr gering und muss oft beurteilt werden, indem eine Kultur direkt neben einen Rohling gehalten wird. Die Ausnahme ist die Population A-3, die sich so entwickelt hat, dass sie Citrat im Medium als zusätzliche Nährstoffquelle verwendet und auf etwa das Zehnfache der Zelldichte der anderen Populationen anwächst.
Messungen der optischen Dichte in den LTEE-Kulturen können auch verwendet werden, um das erwartete Wachstum zu überwachen. Für die Beispiel-Wettbewerbsassays erwarten wir, dass ein fitterer Wettbewerber seine Repräsentation im Laufe der Zeit im Vergleich zu einem weniger fitten Wettbewerber erhöht. Die Untersuchung der TA-Platten mit Kolonien, die aus Verdünnungen von nur einem Replikat der Konkurrenz zwischen den beiden Vorläuferstämmen gezüchtet wurden, zeigt, dass das Verhältnis im Verlauf eines dreitägigen Konkurrenzexperiments relativ konstant bleibt.
Im Gegensatz dazu verdrängt die A+5-Population schnell den REL606-Vorfahren. Und die A-5-Population verdrängt schnell den REL607-Vorfahren. Die beiden entwickelten Populationen sind nahezu gleichauf.
Die Darstellungen der roten und weißen Kolonien bleiben an den drei Wettkampftagen nahezu gleich. Anhand der Koloniezählungen nach einem Tag Kokultur stellen wir fest, dass die Fitness der entwickelten Populationen während der LTEE im Vergleich zu den angestammten Stämmen von E. coli um 60% gestiegen ist. Indem wir die Wettkämpfe weiterhin über mehrere Tage übertragen, können wir die Präzision der relativen Fitnessmessungen für Teilnehmer verbessern, die eng beieinander liegen.
Wenn aber zwei Konkurrenten sehr unterschiedliche Fitnesswerte haben, gibt es nach einem mehrtägigen Wettkampf keine adäquate Darstellung beider Völker mehr, um die relative Fitness zu berechnen. Die Methoden, die wir hier demonstrieren, sind entscheidend für die Untersuchung der einzigartigen historischen Aufzeichnungen des LTEE und für die Fortsetzung dieses Evolutionsexperiments mit offenem Ausgang. Sie können auch einen Ausgangspunkt für andere bieten, die neue Evolutionsexperimente in Betracht ziehen, die sich mit neuen Fragen befassen, neue Umgebungen nutzen und verschiedene Mikroorganismen untersuchen.
