Bereiten Sie sich auf die Immunfärbung vor, indem Sie die Stria vascularis von der Maus präparieren und das Gewebe auf eine 24-Well-Platte geben, die 200 Mikroliter 4%Paraformaldehyd in 1X PBS enthält. Inkubieren Sie das Gewebe 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Führen Sie zwei kurze Waschgänge von 1X PBS auf einem Orbitalshaker bei niedriger Drehzahl durch.
Entfernen Sie das PBS und führen Sie dann eine Permeabilisierung und Blockierung für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur in 300 Mikrolitern PBST-Lösung durch. Anschließend färben Sie das Gewebe über Nacht bei vier Grad Celsius mit dem Primärantikörper. Fügen Sie dann einen sekundären Antikörper hinzu und inkubieren Sie ihn zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei niedriger Drehzahl.
Decken Sie die Platte ab, um den fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper vor Licht zu schützen. Als nächstes bereitest du einen größeren Objektträger vor, indem du zwei kleine Streifen Kleber entlang der 25-mm-Achse anbringst, die etwas kleiner als das 18 x 18 Millimeter große Glasdeckglas sind. Geben Sie einen Tropfen Eindeckreagenz zwischen die Leimstreifen.
Geben Sie mit einer Pinzette mit der Nummer 55 so wenig Gewebe wie möglich auf ein Ende des SV und übertragen Sie es vom PBS auf das Einbettreagenz. Lege ein Ende des Deckglases auf die Stelle, an der ein Streifen Kleber platziert wurde. Lassen Sie dann vorsichtig das Deckglas los, um Luftblasen zu vermeiden.
Versiegeln Sie die Halterung, indem Sie einen Tropfen transparenten Nagellack auf jede Ecke der Halterung tupfen. Beschriften Sie die Probe auf dem Glasdeckglas, weg vom Visualisierungsfeld. Visualisieren Sie das SV-Gewebe unter einem Präpariermikroskop, um sicherzustellen, dass es flach und nicht in der Nähe von Luftblasen liegt.
Wenn das SV-Gewebe nicht richtig ausgerichtet ist, versuchen Sie, Luftblasen herauszudrücken oder entfernen Sie vorsichtig das kleinere Glasabdeckglas und positionieren Sie das SV neu. Eine ganze Halterung von SV aus der P30-Maus wurde präpariert und konfokale Bildgebung durchgeführt. Die ZsGreen-Expression wurde in den intermediären Zellen beobachtet, GSIB4-markierte Endothelzellen und DAPI markierte die Zellkerne.
