Bevor Sie beginnen, führen Sie die Isolierung der synovialen Fibroblasten durch und verwenden Sie die nicht adhärenten Zellen, die in diesem Verfahren aus der kollagenbeschichteten Schale entnommen wurden. Säen Sie die nicht adhärenten Zellen auf 40 bis 60 Millimeter große Schalen, die nicht mit Kollagen beschichtet wurden. Kultivieren Sie die Bulk-Zellen einen Tag lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid.
Um nicht adhärente Lymphozyten zu entfernen, saugen Sie das Nährmedium ab und fügen Sie dann frisches Nährmedium hinzu. Kultivieren Sie die adhärenten Bulk-Zellen für ein bis zwei Wochen mit einem Mediumwechsel alle zwei Tage, während Sie die Konfluenz beibehalten. Anschließend zweimal mit PBS oder HBSS waschen.
Selektion für Synovialmakrophagen, indem Sie mit 0,05 % Trypsin in HBSS behandeln und drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Geben Sie dann das Nährmedium vorsichtig zu 0,05 % Trypsin in HBSS. Gießen Sie das Medium nach diesem Schritt nicht mehr direkt auf die Zellen.
Um abgelöste Zellen zu entfernen, saugen Sie das Nährmedium ab und fügen Sie dann vorsichtig frisches Nährmedium hinzu. Wiederholen Sie dies zwei- bis dreimal und halten Sie die Zellen bis zur Verwendung auf der Schale in frischem Nährmedium. Makrophagen-ähnliche Zellen wurden aus sieben bis acht Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen isoliert und mittels RT-qPCR analysiert.
Die mRNA-Expression der Pan-Makrophagen-Marker CD68, EMR1, ITGAM, CSF1R zeigte eine makrophagenreiche Isolierung aus dem Synovitis-Gewebe. Um die Reinheit von Makrophagen zu bestimmen, wurden Oberflächenproteinmarker für Makrophagen und andere Zelltypen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Mehr als 90 % der Zellen exprimierten die Makrophagenmarker CD45, CD11b und F4/80, während die Expression des neutrophilen Markers Ly6G und des T-Zell-Markers CD3 weniger als 1 % betrug
