Beginnen Sie mit der Inkubation der Skelettmuskelfasern der Ratte mit TMRE bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Starten Sie als Nächstes die Standardsoftware für konfokale Mikroskope und wählen Sie das Konfigurations-Framework aus. Wählen Sie im Dialogfeld "Hardwarekonfiguration" die Option "Laser" aus, und aktivieren Sie die Option "Helium Neon 543".
Greifen Sie über das Erfassungs-Framework auf das Dialogfeld "Erfassung" zu, und wählen Sie den Bereich "XYZ" aus. Wählen Sie dann das Format 512x512 mit einer Geschwindigkeit von 400 Hertz. Wählen Sie unter dem angezeigten Lochfenster beliebige Einheiten aus und geben Sie drei Bereiche für die Lochblende ein.
Wählen Sie im Dialogfeld "Bean Path-Einstellungen" ein 20-faches Wasserimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,7 und einem Emissionswellenlängenfenster von 576 bis 700 Nanometern aus. Wählen Sie DD 488543 und stellen Sie die Laserleistung für den Laser 543 auf 15 % einNach einer 20-minütigen Inkubation wechseln Sie das Inkubationsmedium zweimal. Als nächstes bereiten Sie die Aufnahmekammer mit einem 0,15 Millimeter Boro-Silikatglas-Deckglas vor.
Die Faserbündel werden in die Kammer mit 200 Mikrolitern entspannter Lösung überführt. Nutzen Sie den Hellfeldmodus des konfokalen Mikroskops, um lebensfähige Fasern für die fluoreszierende Aufzeichnung von Mitochondrien zu identifizieren. Anpassen, Verstärken und Versatz, indem Sie die Fluoreszenz mit der Live-Taste scannen.
Wählen Sie niedrige Fluoreszenzintensitätswerte für einen Hintergrund von nahezu null beliebigen Einheiten und ein mitochondriales Signal zwischen 100 und 200 beliebigen Einheiten. Wählen Sie eine Pixelgröße zwischen 150 und 190 Nanometern aus, und passen Sie den Zoomfaktor im Dialogfeld XY an, um die volle Breite der Faser zu erfassen. Legen Sie im Dialogfeld Z-Stapel den Z-Abstand ab einer Fasertiefe von 15 Mikrometern bis zu 22 Mikrometern fest, und wählen Sie eine Z-Schrittweite von 3 Mikrometern aus.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die konfokalen Bilder zu erfassen und einen Z-Stapel zu erhalten, der aus drei konfokalen Bildern besteht, die in einer Tiefe von 15, 18 und 21 Mikrometern aufgenommen wurden. Die konfokalen Bilder einer trainierten Muskelfaser zeigen eine erwartete Aufzeichnung von Skelettmuskelfaser-Mitochondrien mit einem konsistenten Fasermuster. Im Gegensatz dazu zeigt die adipöse Muskelfaser der Ratte erhebliche Veränderungen im mitochondrialen Gehalt und in der Verteilung.
