Starten Sie zunächst die Bildanalysesoftware. Öffnen Sie als Nächstes die Z-Stack-Datei und passen Sie die Ausrichtung an, um die Faser horizontal zu platzieren. Wählen Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse oder einen ROI, der den mitochondrialen Bereich abdeckt.
Wählen Sie Größen von 65 bis 90 Mikrometern in X-Richtung und geeignete Größen in Y-Richtung basierend auf der Faserbreite. Fahren Sie mit dem Duplizieren des Z-Stapels mit dem ausgewählten ROI fort. Und speichern Sie es als neuen Z-Stapel im Tiff-Format.
Speichern Sie die ROI-Position aus dem ursprünglichen Stack mit dem ROI-Manager-Tool. Öffnen Sie das Dialogfeld "Schwellenwert" mit dem Tastenbefehl "Befehl+Umschalt+T". Wählen Sie den Otsu-Schwellenwertalgorithmus und wählen Sie die Option "Schwarzweißer dunkler Hintergrund".
Beobachten Sie das Histogramm der Fluoreszenzintensitätsverteilung und den im Dialogfeld angezeigten Schwellenwert. Wenden Sie den Schwellenwert auf den binären Bildstapel an, wählen Sie dann Schwellenwert für jedes Bild berechnen und erstellen Sie im angezeigten Dialogfeld einen neuen Stapel, bevor Sie auf OK klicken. Speichern Sie den mit drei Binärbildern generierten Stapel im Tiff-Format. Rufen Sie als Nächstes das Menü "Analysieren" auf und wählen Sie "Histogramm" aus.
Klicken Sie im angezeigten Dialogfeld Histogramm auf Ja. Klicken Sie im Dialogfeld Histogramm des Stapels auf Liste, um Histogrammdaten zu erhalten. Übertragen Sie Histogrammdaten in eine Tabellenkalkulation und identifizieren Sie Mito-Pixel mit einem Wert von 255.
Berechnen Sie die Mitochondriendichte, indem Sie die Mito-Pixel durch die Gesamtpixel dividieren und mit 100 multiplizieren. Die adipöse Rattenfaser wies eine geringere mitochondriale Dichte auf. Dies wurde durch die Stapelbildanalyse bestätigt.
