Nehmen Sie zunächst eine geschärfte Kapillare und verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um 2 bis 10 Mikroliter des CRISPR-Cas9-Ribonukleoproteinkomplexes oder der Kontrolllösung zu laden. Anschließend wird die gefüllte Kapillare in den Mikroinjektor-Handler eingesetzt. Brechen Sie die Kapillarspitze mit einer feinen Pinzette ab, um das Auswurfvolumen auf 10 Nanoliter einzustellen.
Positionieren Sie die Embryonen eines Zellstadiums auf einem Gitter, das in eine 100 Millimeter große Petrischale mit 3%iger Polysaccharoselösung geklebt ist. Injizieren Sie mit dem Mikroinjektor und unter einem Stereomikroskop 10 Nanoliter der Lösung in die kortikale Region, insbesondere auf der Ebene des Tierpols unter der zytoplasmatischen Membran. Nach 24 Stunden werden Fluorescein, Lysin und Dextrin unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop visualisiert und gut injizierte Rho-Crispant-Embryonen ausgewählt.
Die Caspase-3-Markierung von Rho-Crispant-Kaulquappen-Netzhäuten zeigte, dass einige Stäbchen eine Apoptose durchlaufen. Die histologische Färbung ergab eine globale Konservierung der Kernschichten, aber eine starke Verkürzung der äußeren Segmente der Photorezeptoren. Weitere Immunfärbeanalysen mit Photorezeptormarkern zeigten die Degeneration der Stäbchenaußensegmente.
