In diesem Video zeigen wir, wie man exogene DNA-Konstrukte in optischen Neuronen ausdrückt und wie man einzelne GFP-exprimierende optische axonale Lauben in intakten, lebenden Xenopus laevis Kaulquappen abbilden kann. Dies ist ein kostengünstiges, einfaches Verfahren für die transiente zellspezifische Transgenese, das die Bestimmung der zellautonomen Genfunktion in einzelnen optischen axonalen Lauben ermöglicht und sich in einem lebenden Wirbeltiermodellsystem entwickelt. Demonstrieren sie das Verfahren von mir, Sophia Dao, Research Assistant, und Dr.Tamira Elul, Lab Principal Investigator.
Zunächst die Spitze einer gezogenen Mikrokapillarpipetten aus Glas vorsichtig mit feinen Zangen beschneiden. Füllen Sie die Mikrokapillarpipeette aus Glas mit Mineralöl mit einem MICROFIL, so dass an der abgeschnittenen Spitze der Mikropipette ein winziger Tropfen Mineralöl erscheint. Füllen Sie die Mikrokapillarpipetten des Glases auf halbem Weg mit Mineralöl.
In einem Injektor den Kolben halb auswerfen und die gezogene Mikrokapillarpipeette aus Glas in den Injektionshalter laden. Dann verlängern Sie den Kolben in vollem Umfang, um zu bestätigen, dass die Mikrokapillarpipette stark am Injektor befestigt ist und sich nicht mit der Verlängerung des Kolbens bewegt. Übertragen Sie einen drei Mikroliter Tropfen der DNA/DOTAP-Mischung auf ein ein Zoll großes quadratisches Blatt Paraffinpapier.
Bewegen Sie unter einem Stereo-Sezierendes Mikroskop die Spitze der Mikrokapillarpipetten aus Glas in den DNA/DOTAP-Tropfen. Verwenden Sie die Fülloption auf dem Injektionsapparat, saugen Sie langsam die DNA/DOTAP Tropfen in das Glas Mikrokapillarpipetette. Die Grenze zwischen mineralöl und der DNA/DOTAP-Lösung ist in der Mikrokapillarpipetten des Glases aufgrund der leichten Opazität der DNA/DOTAP-Lösung sichtbar.
Beenden Sie bei Bedarf die regelmäßige Füllung der Mikrokapillarpipette, damit der Druck in der Mikrokapillarpipetten aus Glas neu kalibriert werden kann. Zuerst, in einer 10 Milliliter Petrischale gefüllt mit 0,1X MMR, manuell devitellinisieren 10 Stufe 20 bis 24 Xenopus Embryonen mit feinen Zangen. Greifen Sie die Vitelline-Hülle an der Taille, um die Embryonen nicht zu verletzen.
Mit Zangen in der linken und rechten Hand des Experimentators, pop die Blase der Vitelline-Hülle und lassen Sie den Embryo aus der Vitelline-Hülle. Achten Sie darauf, die Embryonen nicht zu verletzen, wenn Sie die Vitelline-Hülle entfernen. Dann verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette mit einer geschnittenen Spitze, um fünf bis zehn de-vitellinisierte Stadium 22 bis 24 Embryonen auf eine 10 Milliliter Petrischale mit 1X MMR gefüllt zu übertragen.
Greifen Sie unter einem Stereomikroskop einen der entvitellinisierten Embryonen in der Petrischale mit Dereinspen und ordnen Sie den Embryo so an, dass sein vorderer Pol im Sichtfeld nach oben zeigt. Richten Sie dann den Embryo so aus, dass er seitlich liegt und eine seiner von links nach rechts gerichteten Augenknospen nach oben zeigt. Halten Sie den Embryo mit der Zange in der nicht dominanten Hand des Experimentators und mit der dominanten Hand des Experimentators, führen Sie die Spitze der Glasmikropipette von der ventralen oder dorsalen Seite direkt unter der Epidermis in die Augenknospe ein.
Injizieren Sie zwischen 70 bis 210 Nanoliter der DNA/DOTAP-Lösung. Drehen Sie dann den Embryo um und führen Sie die gleiche Mikroinjektion in die andere Augenknospe auf der kontralateralen Seite des Embryos durch. Injizieren Sie beide Augenknospen von sechs bis zehn Embryonen in jedem Experiment.
Nach der Mikroinjektion Embryonen in einer Petrischale mit 1X MMR ca. 30 Minuten lagern, um die Wundheilung zu erleichtern. Übertragen Sie die injizierten Embryonen nach 30 Minuten mit einer Kunststofftransferpipette in eine 0,1X MMR-Lösung mit 0,001% Bleichmittel Phenylthiocarbamid, um die Pigmentierung zu reduzieren. Bedecken Sie die Petrischale mit einem Deckel, um die Embryonen für etwa fünf Tage zu kultivieren, bis sich die Embryonen in den Stadien 46 bis 47 zu Kaulquappen entwickelt haben.
Dieses Protokoll ergibt eine Erfolgsrate von 30 bis 60% der injizierten Xenopus-Embryonen, die GFP in ein bis zehn optischen axonalen Lauben exezieren. Repräsentative konfokale Bilder von GFP zeigen die exzessende Kontrolle und mutierte optische axonale Lauben in den intakten Xenopus Kaulquappen. Zwei Domänenmutanten von APC, APCNTERM und APBbeta-cat wurden in pCS2-Plasmide geklont.
Die Bilder der GfP-Steuerung und der aPC-mutierten optischen axonalen Lauben wurden rekonstruiert. Plots der Anzahl der Zweige, der gesamten Laubenverzweigungslänge und der mittleren Verzweigungslänge bestätigen beobachtete Unterschiede zwischen Derkontrolle und APC-Mutanten, die axonale Lauben ausdrücken. Zusätzliche Streudiagramme mit einer Anzahl von Zweigen im Vergleich zur mittleren Verzweigungslänge mit Regressionslinien zeigen eine inverse Korrelation zwischen diesen Parametern und optischen axonalen Lauben, die APC-Domänen exemitenieren.
Die Spitze der Mikrokapillarpipette muss sehr oberflächlich in die Augenknospe eingeführt werden, so dass die graue Epidermis, die die Augenknospe überlagert, während jeder Mikroinjektion anschwillt. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um spezifische genetische Funktion in optischen Neuronen zu kennzeichnen und zu verändern, während das Wachstum, targeting und Verzweigung von Axonen aus diesen optischen Neuronen bewertet wird. Diese DNA-Mikroinjektion und Lipofektionstechnik hat es Forschern in der Entwicklungsneurobiologie ermöglicht, zellautonome molekulare Mechanismen zu untersuchen, die die optische Axonarborisierung in intakten, lebenden Xenopus laevis Kaulquappen regulieren.
