Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health: EY015748, EY017964 (MEZ) und EY019517 (ASV). Diese Arbeit wurde von der Forschung unterstützt, um Blindheit gebundene Zuwendung an die Augenklinik und die Lions des Zentral New York verhindern. Wir möchten auch unseren Tiertechniker, Matthew Mellini, für seine hervorragende Betreuung der Tiere und für die Intensivierung in in diesem Video Star danken.

Tierpflege Die Xenopus laevis Kaulquappen in dieser Studie verwendet wurden nach Verfahren, die von Upstate Medical University IACUC und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt angebaut, aufgezogen und behandelt. . Ein Pre-Verhalten Setup: Kaulquappen <ol><li> Erhalten befruchteten Xenopus-Embryonen aus einer handelsüblichen Quelle oder in vitro zu befruchten Oozyten, wie oben beschrieben 6. </li><li> Zeigen Blastula zu Neuralplatte Embryonen bei 18 ˚ C in 60 mm Petrischalen mit 0,1 X MMR [10 X Marc Geändert Ringer-(MMR)-Lösung Lager (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 50 mM HEPES; 1 M NaCl, eingestellt auf pH 7,5, autoklaviert und bei RT gelagert)] mit 50 ug / ml Gentamicin-Antibiotikum. Ändern 0,1 X MMR jeden Tag und entfernen Sie alle toten Embryonen. </li><li> Sobald die Embryonen erreichen Nieuwkoop und Faber Bühne ~ von 27. bis 30. Juli, schalten thE Embryonen in 0,1 × MMR ohne Antibiotikum Darm Bakterienwachstum zu ermöglichen. </li><li> Wachsen die Kaulquappen, bis sie die Fütterungsstufe (Stufe 45) zu erreichen und sie in 100 mm Petrischalen mit 0,1 X MMR gefüllt. Füttere sie Brennnesselpulver Stand jeden zweiten Tag für eine Woche, die Änderung der MMR 0,1 X auf dem dazwischen Tag. </li><li> Nach einer Woche in der 100-mm-Petrischale, verschieben Tiere halben Liter Tanks mit Wasser gefüllt Frosch [0,5 g / L Instant Meer und 2 mM Dinatriumhydrogenphosphat (Na 2 HPO 4: mw 141,96) pH 6,8]. Füttere sie, wie in Schritt 2.4, aber ändern Sie Wasser nur 2-3 mal pro Woche, wenn das Wasser trüb ist. Pflegen Sie die Tiere in einer 12-Stunden-Licht/12 dunklen Lichtzyklus mit die Lichter einschalten um 6 Uhr. </li><li> Legen Sie die Hälfte-Liter-Tank mit den Testpersonen auf einer weißen Fläche wie ein Labortisch Unterlage, mindestens 12 Stunden O / N, vor der Prüfung. </li><li> Test Kaulquappen in Stufen 45 bis 50, wie in Schritt 3 unten beschrieben. </li></ol> . 2 Pre-Verhalten Setup: Equipment <ol><li> Beiseite stellen einen Bereich der Labor-Test für das Verhalten. Es sollte in einer ruhigen, verkehrsarmen Bereich mit Standard-Leuchtstofflampen sein. </li><li> Vorbereitung der Testbehälter für die Tiere. Die verschachtelte, halb-Liter Testbehälter sind aus zwei Teilen: einem Innenbehälter, die das Wasser und Kaulquappen halten wird; und einen äußeren Tank mit dem visuellen Stimulus. <ol><li> Für den Innentank, machen Sie eine kleine Markierung auf den Außenecken mit einem Sharpie, 5 cm aus dem Boden; dies ist die Wasserleitung (1A, grün gestrichelte Linie). </li><li> Auch für den inneren Tank, füllen die divets im Behälter (in den Ecken und der Mitte) mit einer inerten Verbindung, wie Sylgard Elastomer. HINWEIS: Die Kaulquappen werden in diesen Bereichen aufhalten, wenn sie nicht ausgefüllt </li><li> Für den äußeren Behälter, Deckel genau eine Hälfte der Außenseite eines Tanks mit schwarzem Isolierband und die andere Hälfte mit dem weißen Papier 1B. </li></ol></li><li> Legen Sie die Tanks auf dieImpfen Drehscheibe. </li><li> Setup die Webcam / Stativ, so dass es über den Testtanks. Einstellen der Kamera auf die Visualisierung der Testfläche zu ermöglichen, wie in Fig. 1C gezeigt. </li><li> Schließen Sie die Webcam an einen Computer mit Quicktime Player Software installiert 5. Schalten Sie die Kamera ein. Im Quicktime Player unter Datei, wählen Sie &quot;Neue Video-Aufnahme.&quot; Das Verhalten Test-Setup wird sofort auf dem Computer sichtbar sein. </li><li> Drape ein leichtes Baumwolltuch über die gesamte Setup auf externe Signale, die Kaulquappe Verhalten beeinflussen könnten zu reduzieren, als auch auf der Oberfläche des Wassers zu reduzieren reflektierte Licht. </li><li> Sicherzustellen, dass die Leuchtdichte unter dem Tuch Maßnahmen zwischen 35-50 cd / m 2. </li></ol> 3. Verhalten Assay <ol><li> Füllen Sie den Innentank zur Prüfung 5 cm Wassermarke in Schritt 1.2.1 mit Frosch Wasser. </li><li> Mit einem kleinen Netz, sanft bewegen, das Tier in die innere Prüfung Tank. </li><li> Offene QuickTime Software auf dem Computer und mit dem Außentank als Leitfaden, stellen Sie sicher, dass die Kamera in der Lage ist, zu visualisieren und notieren Sie den Testbereich. </li><li> Schreiben Sie die Tiernamen, Datum und Zeit auf ein Stück Papier und notieren mit der Kamera. </li><li> Die Testbehälter in den Außenbehälter mit der schwarzen Seite des Behälters nach rechts 2. </li><li> Starten Sie die Filmaufnahme unmittelbar nach der Anordnung der Tank und setzen Timer für 2 min. </li><li> Nach dem Signal, entfernen Sie die inneren Testtank, drehen Sie den Außentank 180 ° und legen Sie den inneren Testtank im Inneren des Außentanks. Starten Sie den Timer. Hinweis: die schwarze Seite sollte nun auf der anderen Seite sein. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.7, acht weitere Male für insgesamt zehn Studien. Verwenden Sie Abbildung 2 als ein Führer, Abhaken jede Studie. </li><li> Wiederholen Sie den Test Verhalten an zwei verschiedenen Tagen. </li></ol> 4. Retinal Axotomie <ol><li> Tier in den 0,02% Tricaine bis sie nicht mehr reagiert werdenzu einem Schwanz mit einer Prise Nr. 3 Pinzette. </li><li> Schmelze 1% Agarose in 0,1 × MMR und dann zu einer 60 mm Petrischale hinzuzufügen. Nach dem Abkühlen einen kleinen rechteckigen Divot in der Agarose und fügen die Kaulquappe zum Divot mit wenig Tricaine 0,02%, so dass das Tier ist teilweise in die Flüssigkeit eingetaucht. </li><li> Die Schale in einem 45 Grad-Winkel hinter dem dorsalen Bereich des Auges mit einer 25 G Nadel, während die Abstützung des Tieres gegen Zange an der gegenüberliegenden Seite. </li><li> Kümmert sich nicht um die Ader, die neben dem Sehnerv liegt schnippeln, zu erreichen sorgfältig in das Loch mit der Pinzette Nr. 5, schnipp den Sehnerv und drehen Sie sie aus dem Weg. Wenn es schwere Blutungen aufgrund versehentlich Kappen der Arterie, dann schnell zu platzieren, das Tier in 2% Tricaine zu einschläfern. ACHTUNG: 2% Tricaine Lösung kann Taubheitsgefühl in den Menschen verursachen. Diese Lösung sollte mit Handschuhen angefasst werden. </li><li> Um das Tier zu bergen nach der Operation, legen Tier in 100 mm Petrischale mit 0,7 X MMR und 50 ug / ml Gentamicin für 20 min. Next, Transfer Kaulquappe zum Frosch Rückgewinnungstank mit Wasser. Lassen Tier Rest O / N. </li><li> Am nächsten Morgen, testen Sie die visuelle Funktion wie oben beschrieben (Schritte von 3,1 bis 3,9). </li></ol> 5. Analysieren Ergebnisse <ol><li> Nachdem die Studien abgeschlossen haben, messen Sie die Zeit, die der Kaulquappe bleibt auf der schwarzen Seite des Tanks. <ol><li> Manuell die Videos mit einer Software, die die Zeit anzeigt und ermöglicht häufigen Pausen. Schauen Sie sich die Video-Anzeigezeit. Notieren den Beginn der zwei-Minuten-Studie, die ist, wenn der Innentank erfolgreich verschachtelt innerhalb des Außenbehälters und wird im Hinblick auf die Kamera quadriert. </li><li> Verwenden Sie die Position der Augen des Kaulquappe ist zu definieren, welche Seite des Tanks werden die Tiere schwimmen auf. Definieren Sie über Kreuzung von einer Seite des Tanks auf die andere nur dann, wenn beide Augen haben die schwarz / weiße Linie gekreuzt. </li></ol></li><li> Notieren Sie sich den Anfang und das Ende jedes Intervalls (in sec), dass das Tier auf der schwarzen Seite verbringt. Pause und Wiederwickeln Sie das Video, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Insgesamt sec die in jeder Studie. </li><li> Eingangs diese Zahlen in der beigefügten Verhalten Arbeitsblatt. Das Arbeitsblatt wird das Verhältnis der Zeit, dass das Tier auf der weißen Seite verbracht, indem die Zeit auf der schwarzen Seite des Tanks von der Gesamt 120 sec Versuch und Division durch die Gesamtzeit in Sekunden ausgegeben berechnen [(120 - Gesamtaufwand für Sekunden die schwarze Seite) / 120 sec]. Die Arbeitsblattdurchschnittswerte dieses Verhältnis über alle 10 Studien. </li><li> Verwenden Sie ein Student-T-Test, gepaart, two-tailed Verteilung zu bestimmen, ob die Prozesse zwischen den Tagen sind signifikant (P ≤ 0,05). </li></ol>

<ol>
	<li>Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+zebrafish+oculomotor+behavior+to+model+human+disorders.">Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders.</a> Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).</li><li>Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+temporal+properties+of+the+rod+pathway+in+larval+Xenopus.">Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus.</a> J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).</li><li>Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preference+for+background+color+of+the+Xenopus+laevis+tadpole.">Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole.</a> J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).</li><li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells.">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7 (8), (2009).</li><li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration.">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).</li><li>Viczian, A. S., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+determination+using+the+animal+cap+transplant+(ACT)+assay+in+Xenopus+laevis.">Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis.</a> J Vis Exp. 16 (39), (2010).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second-generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+molecularly-tractable+model+organisms.">A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms.</a> PLoS One. 5 (12), (2010).</li><li>Rosemberg, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+spatio-temporal+behavior+of+zebrafish+in+the+open+tank+paradigm+after+a+short-period+confinement+into+dark+and+bright+environments.">Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li><li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Avoidance+in+Xenopus+Tadpoles+is+Correlated+With+the+Maturation+of+Visual+Responses+in+the+Optic+Tectum.">Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum.</a> J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li><li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+Elicits+Retinal+Fate+In+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells.">Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).</li><li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos.">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wir berichten hier über eine einfache Vision geführte Verhaltenstest, die leicht in weniger als einer Woche durch minimal geschulte Laborpersonal durchgeführt werden können. Während andere Tests erfordern spezielle Ausrüstung und Know-how in das Verhalten der Tiere, ermöglicht dieser Test ein Schnelltest der visuellen Funktion zu bestimmen. Ein anderer Verhaltenstest, der Visual Avoidance Assay wurde entwickelt, um zu bestimmen, wie Tectum trägt zur visuellen Wahrnehmung in Xenopus 10. Dieser...

Xenopus laevis wurden als Modellorganismus zur Augenbildung studieren verwendet. Die Augen entwickeln schnell wachsenden Zeit in weniger als einer Woche zum Testen Gene oder Wege, die einen Einfluss auf die visuelle Entwicklung und Funktion haben. Um visuelle Funktion zu testen, hat die optokinetischen und optomotorischen Reaktion im Zebrafisch und Xenopus Kaulquappen verwendet wurde, bzw. 1,2. Da die Augen von Xenopus Kaulquappen sind relativ kleiner als Zebrafisch, dieser Test erfordert den Einsatz von Spezialgeräten und geschultes Personal, um die subtilen tail-Flip und Blickbewegungsverhalten in Xenopus zu erkennen. Ein robusteres Verhalten in Xenopus ist die Vorliebe für das Schwimmen in einem Tank mit einem weißen Hintergrund, die hier 3 beschrieben wird. Beim Platzieren einer Kaulquappe in einem halb schwarz / halb-weißen Tank, die Pre-metamorphen Kaulquappe schnell schwimmt auf der weißen Seite des Tanks. Bislang hatten wir diesen Test, um festzustellen, ob pluripotenten Zellen abgeleitetenAugen waren funktionellen 4. Hier berichten wir über eine detaillierte Version dieses Assays, die verwendet werden können, um die visuelle Funktion premetamorphic Xenopus-Kaulquappen testen. Dieser Test ist einfacher als der optomotorischen Reaktion Assay, da bedarf es nur einen montierten digitalen Camcorder, Digitalkamera-Software und Standard-Ausrüstung in den meisten Labors Xenopus gefunden. Darüber hinaus ist die aufgezeichnete Reaktion erfordert keine spezielle Ausbildung, um tally Ergebnisse. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die gleiche Gruppe von Kaulquappen, mit Doppelnetzhaut Axotomie unterzogen, schwimmen zufällig um den Tank. Wir haben auch die Verhaltens Assay-Ergebnisse aus einer repräsentativen Kaulquappe, die zeigt, wie ein Auge für die visuelle Reaktion getestet werden. Ein Arbeitsblatt aufgenommen wurde, so daß während des Tests erworben Zahlen eingesetzt und ausgewertet werden. Dieses Arbeitsblatt kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob die getesteten Kaulquappen eine visuelle Antwort sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1/2-gal. Flex-Tank with Cover</td>
			<td style="width:95px;">eNasco</td>
			<td style="width:119px;">SB19271M</td>
			<td style="width:225px;">size: 5-3/8&#34; x 7&#34; x 3-3/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Black electrical tape</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">White tissue paper</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Large Inoculating Turntable</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">50809-022</td>
			<td>size: Dia 114.3 x&#160; H 76.2 mm (4 1/2&#160; x&#160; 3&#34;)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Durasorb Underpad</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82004-836</td>
			<td>size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24&#34;)</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Kim wipe</td>
			<td style="width:95px;">Krackeler Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1945-34155-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard Tripod</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;">various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iSight camera or webcam</td>
			<td style="width:95px;">Apple</td>
			<td style="width:119px;">M8817LL/A</td>
			<td>Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Portable computer</td>
			<td style="width:95px;">Apple/PC</td>
			<td style="width:119px;">various</td>
			<td>We used a 13&#34; MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiniDV Handycam Camcorder</td>
			<td style="width:95px;">SONY</td>
			<td style="width:119px;">DCR-HC42</td>
			<td>Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Handycam Station</td>
			<td style="width:95px;">SONY</td>
			<td style="width:119px;">DCRA-C121</td>
			<td>This can be used for connecting firewire to camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QuickTime Player software</td>
			<td style="width:95px;">Quicktime</td>
			<td style="width:119px;">Version 10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">26 Gauge Needle (5/8&#34; length)</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Dumont #5 Forceps Biology</td>
			<td style="width:95px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Disposables</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Gentamicin Sulfate [50 mg/ml]</td>
			<td style="width:95px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17-528Z</td>
			<td>Stored at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer</td>
			<td style="width:95px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9644388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:95px;">Doctors Foster and Smith</td>
			<td style="width:119px;">CD-116528</td>
			<td>Stock solution = 100 g/L stored at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:95px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0876</td>
			<td>Stock solution = 0.4 M stored at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Tricaine (Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td style="width:95px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td>Stock solution = 10% stored at -20&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">In vitro fertilized embryos</td>
			<td style="width:95px;">eNasco</td>
			<td style="width:119px;">LM00490MX</td>
			<td>100 embryos/unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple behavioral assay for testing visual function in xenopus laevis

Die Messung der visuellen Funktion in den Kaulquappen der Frösche, Xenopus laevis, ermöglicht Screening für Blindheit in lebenden Tieren. Der optokinetische Reaktion ist eine Vision-basierte, reflexive Verhalten, das in allen getesteten Wirbeltieren beobachtet worden ist. Tadpole Augen sind klein, so wurde der Schwanz Flip Antwort als alternative Maßnahme, die einen geschulten Techniker, um die subtile Antwort aufzeichnen erfordert verwendet. Wir haben eine alternative Verhalten Assay basiert auf der Tatsache, dass Kaulquappen lieber auf der weißen Seite eines Tanks schwimmen, wenn sie in einem Behälter mit sowohl Schwarz-Weiß-Seiten angeordnet. Die hier vorgestellte Test ist eine kostengünstige, einfache Alternative, die eine Antwort, die leicht gemessen wird erstellt. Der Aufbau besteht aus einem Stativ, Webcam und verschachtelte Prüfung Tanks, in den meisten Labors Xenopus leicht verfügbar. Dieser Artikel enthält einen Film, die das Verhalten von Kaulquappen, vor und nach dem Durchtrennen des Sehnervs. Um die Funktion von einem Auge zu testen, sind wir auch Vertretreter Ergebnisse einer Kaulquappe, in dem jedes Auge unterzog Netzhaut Axotomie an aufeinander folgenden Tagen. Zukünftige Studien könnten eine automatisierte Version dieses Tests für die Prüfung der Vision von vielen Kaulquappen auf einmal zu entwickeln.

Frühere Berichte haben gezeigt, dass Xenopus Kaulquappen premetamorphic lieber auf der weißen Seite einer schwarz / weißen Tank schwimmen und nannte diesen Test, der Hintergrundfarbe Vorlieben Assay 3 Wir haben diesen Test, um die visuelle Funktion eines Augen von Kaulquappen in testen geändert weniger als eine Woche. Auf diese Weise kann die Augen für die histologische Untersuchung gesammelt werden. Wir zeigen hier, wie die Reaktion durch visuelle Hinweise ist. In <...

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A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis Kaulquappen schwimmen lieber auf der weißen Seite einer schwarz / weißen Tank. Dieses Verhalten wird von ihrer Vision geleitet. Basierend auf diesem Verhalten stellen wir eine einfache Test, um die visuelle Funktion der Kaulquappen zu testen.

Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

a-simple-behavioral-assay-for-testing-visual-function-xenopus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

9.7K Aufrufe.  Center for Vision Research, SUNY Eye Institute, Upstate Medical University.  Xenopus laevis Kaulquappen schwimmen lieber auf der weißen Seite einer schwarz / weißen Tank. Dieses Verhalten wird von ihrer Vision geleitet. Basierend auf diesem Verhalten stellen wir eine einfache Test, um die visuelle Funktion der Kaulquappen zu testen. 

Serie: A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended upon this work to develop a simple quantitative measure of forepaw dexterity that is sensitive to lateralized impairments and age-dependent changes. Rodents learn skillful forepaw and digit movements to manage thin pasta pieces, which they eagerly consume. We have previously described methods for quantifying vermicelli handling in rats and showed that the measures are very sensitive to forelimb impairments resulting from unilateral ischemic lesions, middle cerebral artery occlusions and unilateral striatal dopamine depletion [Allred, R.P., Adkins, D.L., Woodlee, M.T., Husbands, L.C., Maldonado M.A., Kane, J.R., Schallert, T. &amp; Jones, T.A. The Vermicelli Handling Test: a simple quantitative measure of dexterous forepaw function in rats. J. Neurosci. Methods 170, 229-244 (2008)]. Here we present a more detailed protocol for this test in rats and compare it with a newly developed version for mice, the Capellini Handling Test. Rats and mice are videotaped while handling short lengths of uncooked vermicelli or capellini pasta, respectively, with a camera positioned to optimize the view of paw movements. Slow motion video playback allows for the identification of forepaw adjustments, defined as any distinct removal and replacement of the paw, or of any number of digits, on the pasta piece after eating commences. Forepaw adjustments per piece are averaged over trials per each testing session. Repeated testing permits sensitive quantitative analysis of changes in forepaw dexterity over time. Protocols for pre-testing habituation and handling practice, as well as procedures for characterizing atypical handling patterns, are described. Because rats and mice perform the pasta handling tests slightly differently, species-specific differences in administration and scoring of these tests are highlighted. All animal use was in accordance with protocols approved by the University of Texas at Austin Animal Care and Use Committee.

The Vermicelli and Capellini Handling Tests of forepaw dexterity take advantage of the natural inclination of rodents to manipulate food items using skillful forepaw and digit movements. Animals are videotaped while handling short strands of uncooked dry pasta. Slow motion video playback allows for the quantification of forepaw adjustments.

Die Vermicelli und Capellini Handhabung Tests: Einfache quantitative Maßnahmen der geschickten Vorderpfote Funktion bei Ratten und Mäusen

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

Forschung

Neurowissenschaften

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and relapse to food taking 1. Food craving conceptualized in this way is akin to drug craving in response to drug-paired cues. A rich literature has been developed around understanding the behavioral and neurobiological determinants of drug craving; we and others have been focusing recently on translating techniques from basic addiction research to better understand addiction-like behaviors related to food 2-4.
As done in previous studies of drug craving, we examine sucrose craving behavior by utilizing a rat model of relapse. In this model, rats self-administer either drug or food in sessions over several days. In a session, lever responding delivers the reward along with a tone+light stimulus. Craving behavior is then operationally defined as responding in a subsequent session where the reward is not available. Rats will reliably respond for the tone+light stimulus, likely due to its acquired conditioned reinforcing properties 5. This behavior is sometimes referred to as sucrose seeking or cue reactivity. In the present discussion we will use the term "sucrose craving" to subsume both of these constructs.
In the past decade, we have focused on how the length of time following reward self-administration influences reward craving. Interestingly, rats increase responding for the reward-paired cue over the course of several weeks of a period of forced-abstinence. This "incubation of craving" is observed in rats that have self-administered either food or drugs of abuse 4,6. This time-dependent increase in craving we have identified in the animal model may have great potential relevance to human drug and food addiction behaviors.
Here we present a protocol for assessing incubation of sucrose craving in rats. Variants of the procedure will be indicated where craving is assessed as responding for a discrete sucrose-paired cue following extinction of lever pressing within the sucrose self-administration context (Extinction without cues) or as responding for sucrose-paired cues in a general extinction context (Extinction with cues).

Responding for food or drug-paired cues increases over the course of a period of abstinence and this may relate to an increased susceptibility to relapse behaviors. Here we detail a procedure for evaluating this "incubation of craving" in rats that have self-administered sucrose.

Eine allgemeine Methode zur Bewertung der Inkubation von Saccharose Craving in Ratten

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Neural Explantatkulturen aus<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissection, Kultur und Analyse der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Netzhautgewebe

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Hippocampus Insulin Mikroinjektion und<em&gt; In vivo</em&gt; Microdialysis Während Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and sensorimotor plasticity1. Consistent sensory perturbations result in compensatory changes in motor output, reflecting changes in feedforward motor control that reduce the experienced feedback error. By quantifying how different sensory feedback errors affect human behavior, prior studies have explored how visual signals are used to recalibrate arm movements2,3 and auditory feedback is used to modify speech production4-7. The strength of this approach rests on the ability to mimic naturalistic errors in behavior, allowing the experimenter to observe how experienced errors in production are used to recalibrate motor output.
Songbirds provide an excellent animal model for investigating the neural basis of sensorimotor control and plasticity8,9. The songbird brain provides a well-defined circuit in which the areas necessary for song learning are spatially separated from those required for song production, and neural recording and lesion studies have made significant advances in understanding how different brain areas contribute to vocal behavior9-12. However, the lack of a naturalistic error-correction paradigm - in which a known acoustic parameter is perturbed by the experimenter and then corrected by the songbird - has made it difficult to understand the computations underlying vocal learning or how different elements of the neural circuit contribute to the correction of vocal errors13.
The technique described here gives the experimenter precise control over auditory feedback errors in singing birds, allowing the introduction of arbitrary sensory errors that can be used to drive vocal learning. Online sound-processing equipment is used to introduce a known perturbation to the acoustics of song, and a miniaturized headphones apparatus is used to replace a songbird's natural auditory feedback with the perturbed signal in real time. We have used this paradigm to perturb the fundamental frequency (pitch) of auditory feedback in adult songbirds, providing the first demonstration that adult birds maintain vocal performance using error correction14. The present protocol can be used to implement a wide range of sensory feedback perturbations (including but not limited to pitch shifts) to investigate the computational and neurophysiological basis of vocal learning.

We describe the design and assembly of miniaturized headphones suitable for replacing a songbird&#x2019;s natural auditory feedback with a manipulated acoustic signal. Online sound processing hardware is used to manipulate song output, introduce real-time errors in auditory feedback via the headphones, and drive vocal motor learning.

Ein Leichtes, Kopfhörer-basierte System zur Manipulation Auditory Feedback in Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Ein Verhaltenstest für Mechanosensation der MARCM-basierte Klonen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Aufzeichnung von Temperatur-induzierte neuronale Aktivität durch Calcium Überwachen von Änderungen in der Riechkolben von<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...