Beginnen Sie mit der Einbettung von Lungengewebe und Agarose und dem Schneiden mit einem Vibratom. Zu den geschnittenen Geweben fügen Sie 300 Mikroliter des Blockers hinzu. Die Platte bei vier Grad Celsius auf einem Shaker unter leichtem Rühren 45 Minuten lang inkubieren.
Als nächstes werden 300 Mikroliter des PBS-verdünnten Primärantikörpers in jede Vertiefung pipettiert. Den Teller über Nacht bei vier Grad Celsius mit leichtem Schütteln inkubieren. Pipettieren Sie nun vorsichtig die Primärantikörper heraus, ohne die Scheibe zu berühren.
Waschen Sie die Scheiben dreimal mit 400 Mikrolitern PBS. Als nächstes pipettieren Sie 300 Mikroliter der verdünnten Sekundärantikörper in jede Vertiefung. Entfernen Sie die Antikörperlösung nach einer 90-minütigen Kaltinkubation.
Geben Sie dann das DAPI und das Tomatenlektin 488 in die Vertiefungen. Die Mischung 30 Minuten lang inkubieren. Nachdem Sie DAPI und Tomatenlektin entfernt haben, waschen Sie die Scheiben in PBS für drei Zyklen à 10 Minuten.
Übertragen Sie die Scheiben mit einem Pinsel auf eine Folie. Geben Sie drei Tropfen Eindeckmedium auf den Objektträger und kleben Sie vor der Aufnahme ein Deckglas darüber. Die Lungenschnitte von Maus-, Schweine- und Menschenproben wurden immunfluoreszenzgefärbt auf SMA, Elastin und LEA.
Es wurde beobachtet, dass SMA und Elastin über Strukturen wie Alveolargänge, Blutgefäße, Bronchiolen und Alveolen verteilt sind. Es wurde ein Vergleich der Typ-II-Pneumozytenverteilung bei erwachsenen und Säuglingen durchgeführt. Der Typ-II-Alveolarzell-Antikörper HT2-280 wies eine starke Affinität zur Zelloberfläche der Pneumozyten auf.
Die Säuglingsprobe ergab eine signifikant höhere Typ-II-Pneumozytenzahl. Allerdings wies die Säuglingsprobe auch eine signifikant höhere Gerüstabdeckung auf als die des Erwachsenen. Auch die Anzahl der Typ-II-Pneumozyten auf Basis der Gerüstabdeckung war bei den Säuglingen signifikant höher.
