저자들은 발렌베리 분자 의학 재단(Wallenberg Molecular Medicine Foundation)과 룬드 대학교(Lund University)의 줄기 세포 센터(Stem Cell Center)로부터 받은 자금 지원에 감사하며, 니콘 A1RHD에 대한 접근을 위해 룬드 대학교 바이오이미징 센터(LBIC)에 감사를 표합니다.

쥐의 폐는 3R을 유지하기 위한 노력의 일환으로 다른 장기 시스템을 사용하는 연구자들에 의해 기증되었다. 돼지에 대한 모든 절차는 유럽 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었으며 말뫼-룬드 동물 연구 윤리 위원회(Dnr 5.8.18-05527/2019)의 승인을 받았으며 스웨덴 연구 위원회의 CODEX 지침에 따라 수행되었습니다. 스웨덴 국가 윤리 위원회(Dnr 2020-07115 및 Dnr 2020-01864)에서 인체 샘플 사용에 대한 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 도구와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 용액 및 재료 준비
<ol><li>폐 조직을 4% 파라포름알데히드에 넣어 실온에서 48시간 동안 고정합니다. 그런 다음 폐 조직을 0.01% 아지드화나트륨을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS)로 채워진 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>멸균 PBS 50mL에 저융점 아가로스 1.5g을 용해시켜 3%(w/v) 아가로스 용액을 준비합니다. 플라스틱 컵, 고운 집게, 멸균 가위를 준비하십시오.</li>
	<li>아가로스를 전자레인지에 넣고 끓을 때까지 가열한 다음 수조에서 42°C로 식힙니다. 아가로스를 사용할 준비가 될 때까지 수조에 보관하여 액체 형태로 유지하십시오. 알림: 아가로스를 가열하는 동안 전자레인지가 끓기 시작할 때까지 지켜보아 넘치지 않도록 하십시오. 보통 1.5분 정도 걸립니다.</li>
</ol>2. 아가로스에 묻힌 폐 조직
<ol><li>PBS-azide에서 폐 생검을 들어 올리고 미세한 겸자와 멸균 가위를 사용하여 폐엽을 조심스럽게 절개합니다. 폐 엽을 더 작은 블록으로 자릅니다. 알림: 흉막으로 절편할 수 있지만 두꺼운 엘라스틴 다발은 비브라톰 블레이드로 절단하는 데 방해가 될 수 있습니다. 따라서 필요하지 않은 경우 제거하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>플라스틱 컵을 가운데로 자르고 바닥에 소량의 아가로스를 넣으십시오. 아가로스 표면에 50mL 원뿔형 튜브(테두리 제거)의 뚜껑을 놓고 컵을 4°C에서 5분 동안 보관하여 나중에 사용할 수 있도록 아가로스가 응고되도록 합니다.</li>
	<li>4°C 냉장고에서 플라스틱 컵을 꺼내 뚜껑에 약 1mL의 액체 아가로스를 넣은 다음 폐 조직 블록을 뚜껑에 부드럽게 놓습니다. 아가로스를 실온에서 반응고되도록 2-3분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 액체가 완전히 잠길 때까지 폐 조직에 아가로스를 천천히 붓습니다.</li>
	<li>아가로스가 굳을 때까지 4°C에서 약 15분 동안 냉장 보관합니다. 그런 다음 날카로운 칼날을 조심스럽게 사용하여 폐 조직을 둘러싼 여분의 아가로스를 제거하고 조직 주위에 약 5mm 두께의 균일한 층을 남깁니다(그림 1).</li>
</ol>3. 폐 조직 절편 절단
<ol><li>절편을 위해 폐 조직을 준비하려면 초강력 접착제를 사용하여 각 조직 블록을 진동체의 표본 디스크에 부착합니다. 그런 다음 비브라톰 버퍼 트레이에 PBS를 채우고 주변 얼음 수조에 얼음을 넣습니다. 마지막으로 시편 디스크를 버퍼 트레이에 조심스럽게 설치합니다.</li>
	<li>두께: 200μm, 주파수: 100Hz, 칼날 진폭: 1.3mm, 칼날의 전진 속도는 조직 강성에 따라 다름 0.02-0.03mm/s로 진동으로 폐 조직을 자릅니다. 알림: 블레이드 속도를 70mm/s로 줄이면 두께 0.01μm까지 절단할 수 있습니다. 특정 진동체(예: Leica V1200s)는 절단 창을 설정하여 절편을 자동화할 수 있습니다.</li>
	<li>절편을 모으려면 브러시로 티슈 조각을 비브라톰 트레이에서 떠서 PBS의 0.01% 아지드로 채워진 24웰 플레이트로 부드럽게 옮깁니다. 마지막으로 폐 절편을 4°C에서 보존합니다.</li>
</ol>4. 엘라스틴, CD31, HTII-280 및 SMA의 면역염색
<ol><li>4°C에서 45분 동안 부드럽게 흔들면서 조직을 투과시키고 차단합니다(1% 소 혈청 알부민 + 0.5% 트리톤 + 5% 일반 염소 혈청).</li>
	<li>1차 항체를 희석한다(SMA 1:500; 엘라스틴 1:250; CD31 1:250; HTII-280 1:250)을 PBS에 넣고 웰당 300μL를 넣고 4°C에서 부드럽게 흔들면서 밤새 배양합니다.</li>
	<li>슬라이스를 만지지 않고 피펫 팁으로 1차 항체를 제거하지 않고 PBS로 3 x 20분(400μL)을 세척합니다.</li>
	<li>2차 항체(1:1000)를 PBS에 희석하고, 웰당 300μL를 첨가하고, 4°C에서 90분 동안 부드럽게 흔들면서 배양합니다.</li>
	<li>피펫 팁으로 2차 항체를 제거하고 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(1:1000) 및 tomato lectin-488 (1:500)을 추가하여 30분 배양하고 PBS로 3 x 10분 동안 세척합니다.</li>
	<li>슬라이드에 장착 매체 3방울을 떨어뜨리고 커버슬립을 장착한 다음 이미징을 진행합니다.</li>
</ol>

Agarose-embedded vibratome section을 사용한 혁신적인 폐 이미징

<ol>
	<li>Morin, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+in+vitro+lung+physio-pharmacotoxicology+studies.">Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies.</a> Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).</li><li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NanoSuit+method:+a+novel+histological+approach+for+examining+paraffin+sections+in+a+nondestructive+manner+by+correlative+light+and+electron+microscopy.">The NanoSuit method: a novel histological approach for examining paraffin sections in a nondestructive manner by correlative light and electron microscopy.</a> Laboratory Investigation. 100 (1), 161-173 (2020).</li><li>Silva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Semi-quantitative+scoring+system+for+green+histopathological+evaluation+of+large+animal+models+of+acute+lung+injury.">A Semi-quantitative scoring system for green histopathological evaluation of large animal models of acute lung injury.</a> BIO-PROTOCOL. 12 (16), e4493 (2022).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+tissue-clearing+conditions+based+on+analysis+of+the+critical+factors+affecting+tissue-clearing+procedures.">Optimizing tissue-clearing conditions based on analysis of the critical factors affecting tissue-clearing procedures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12815 (2018).</li><li>Jain, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry+for+predictive+biomarker+testing+in+lung+cancer+cytology.">Immunocytochemistry for predictive biomarker testing in lung cancer cytology.</a> Cancer Cytopathology. 127 (5), 325-339 (2019).</li><li>Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+stains:+a+literature+review+and+case+study.">Histological stains: a literature review and case study.</a> Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2015).</li><li>Morrison, L. E., Lefever, M. R., Lewis, H. N., Kapadia, M. J., Bauer, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+histological+and+cytological+staining+with+simultaneous+immunohistochemistry+enabled+by+invisible+chromogens.">Conventional histological and cytological staining with simultaneous immunohistochemistry enabled by invisible chromogens.</a> Laboratory Investigation. 102 (5), 545-553 (2022).</li><li>Dineshshankar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kerosene+as+an+alternative+to+xylene+in+histopathological+tissue+processing+and+staining:+An+experimental+study.">Kerosene as an alternative to xylene in histopathological tissue processing and staining: An experimental study.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11 (6), 376 (2019).</li><li>Abdelaal, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+vibratome+and+compresstome+sectioning+of+fresh+primate+lymphoid+and+genital+tissues+for+in+situ+MHC-tetramer+and+immunofluorescence+staining.">Comparison of vibratome and compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining.</a> Biological Procedures Online. 17 (1), 2 (2015).</li><li>Siwczak, F., Hiller, C., Pfannkuche, H., Schneider, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+vibrating+microtome+tissue+slices+as+a+3D+model+in+biomedical+research.">Culture of vibrating microtome tissue slices as a 3D model in biomedical research.</a> Journal of Biological Engineering. 17 (1), 36 (2023).</li><li>B&#232;chet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glymphatic+pathways+in+the+gyrencephalic+brain.">Glymphatic pathways in the gyrencephalic brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 41 (9), 2264-2279 (2021).</li><li>B&#232;chet, N. B., Kylkilahti, T. M., Mattsson, B., Petrasova, M., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+of+optically+cleared+brains+for+studying+the+glymphatic+system.">Light sheet fluorescence microscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).</li><li>Bai, Y., Ai, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+the+precision-cut+lung+slice+to+study+the+contractile+regulation+of+airway+and+intrapulmonary+arterial+smooth+muscle.">Utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (183), (2022).</li><li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+(3D-LTCs)+for+disease+modeling.">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology &amp; Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Organ, L., Donovan, C., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+precision+cut+lung+slices&#8212;powerful+tools+for+investigation+of+mechanisms+and+therapeutic+targets+in+lung+diseases.">Perspectives on precision cut lung slices&#8212;powerful tools for investigation of mechanisms and therapeutic targets in lung diseases.</a> Frontiers in Pharmacology. 14, 1162889 (2023).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Cooper, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formoterol+and+salmeterol+induce+a+similar+degree+of+&#946;+2-+adrenoceptor+tolerance+in+human+small+airways+but+via+different+mechanisms.">Formoterol and salmeterol induce a similar degree of &#946; 2- adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).</li><li>Ochoa, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+murine+whole+lung+fibrosis+by+large+scale+3D+microscopy+aided+by+tissue+optical+clearing.">Imaging of murine whole lung fibrosis by large scale 3D microscopy aided by tissue optical clearing.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13348 (2018).</li><li>Tehrani, K. F., Park, J., Chaney, E. J., Tu, H., Boppart, S. 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T., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+the+pleura:+What+the+pulmonologists+need+to+know.">Pathology of the pleura: What the pulmonologists need to know.</a> Respirology. 16 (3), 430-438 (2011).</li><li>Jantz, M. A., Antony, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleural+fibrosis.">Pleural fibrosis.</a> Clinics in Chest Medicine. 27 (2), 181-191 (2006).</li><li>Viana, F., O&#8217;Kane, C. M., Schroeder, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+lung+slices:+A+powerful+ex+vivo+model+to+investigate+respiratory+infectious+diseases.">Precision-cut lung slices: A powerful ex vivo model to investigate respiratory infectious diseases.</a> Molecular Microbiology. 117 (3), 578-588 (2022).</li><li>Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Videomorphometric+analysis+of+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+of+intra-pulmonary+arteries+using+murine+precision+cut+lung+slices.">Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e50970 (2014).</li><li>Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+mouse+lung+slices+to+visualize+live+pulmonary+dendritic+cells.">Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55465 (2017).</li><li>Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+ex+vivo+pulmonary+vessel+structure+and+contractility+studies.">Precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62392 (2021).</li><li>Ghaidan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+primary+graft+dysfunction+using+cytokine+adsorption+during+organ+preservation+and+after+lung+transplantation.">Reduction of primary graft dysfunction using cytokine adsorption during organ preservation and after lung transplantation.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform.">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985 (1985).</li><li>Ruaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+mystery+of+alveolar+epithelial+type+II+cells:+focus+on+their+physiologic+and+pathologic+role+in+lung.">The history and mystery of alveolar epithelial type II cells: focus on their physiologic and pathologic role in lung.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2566 (2021).</li><li>Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. 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X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirtuin+3+ameliorates+lung+senescence+and+improves+type+II+alveolar+epithelial+cell+function+by+enhancing+the+FoxO3a-dependent+antioxidant+defense+mechanism.">Sirtuin 3 ameliorates lung senescence and improves type II alveolar epithelial cell function by enhancing the FoxO3a-dependent antioxidant defense mechanism.</a> Stem Cells and Development. 30 (17), 843-855 (2021).</li><li>Zacharias, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+lung+alveolus+by+an+evolutionarily+conserved+epithelial+progenitor.">Regeneration of the lung alveolus by an evolutionarily conserved epithelial progenitor.</a> Nature. 555 (7695), 251-255 (2018).</li><li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. 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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜에서는 폐 절편을 생성하기 위한 개선된 비브라톰 기반 방법을 제시합니다. 파라핀 기반 처리 기술과 비교했을 때, 이 방법은 더 비용 효율적이고, 시간 효율적이며, 환경에 더 좋다22. 또한 이 방법은 폐 조직 절편의 구조적 무결성을 유지하는 데 도움이 되며 항원 검색 없이 고급 면역형광 이미징을 가능하게 합니다. 그러나 실험 중에 이 워크플로에 대한 특정 제한 사항도 발견했습니다. 병든 폐는 병리학적 변화로 인한 조직 파괴로 인해 절단 과정을 방해할 수 있습니다. 절개에 비브라톰을 사용하는 동안 기도 폐쇄 및 심각한 섬유화 폐 조직은 칼날을 방해하여 이러한 조직을 절단하는 과정을 더 어렵게 만들 수 있습니다. 그러나 이것은 칼날 속도를 줄이고 가는 붓으로 조직을 지지함으로써 극복할 수 있습니다. 늑막염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 및 특발성 폐섬유증(IPF)에서 흔히 발생하는 흉막의 비후로 인해 유사한 문제가 발생합니다.23,24,25. 흉막이 실험에 적합하지 않은 경우, 절개하기 전에 흉막을 제거하거나 흉막에서 폐 용적을 분리하는 것이 좋습니다. 흉막이 필요한 경우 위와 유사한 조작을 사용하여 슬라이스할 수 있으며, 블레이드 속도를 늦추고 미세한 브러시로 슬라이스를 지지합니다.
정밀하게 절단된 폐 절편은 폐의 3차원 구조와 본래의 환경을 보존할 수 있지만(26), PCLS를 생성하는 것은 복잡하고 시간이 많이 걸리는 과정이라는 점에 유의하는 것이 중요하다. 폐 조직 절편 생성의 성공 여부는 아가로스 충전의 효율성에 크게 좌우되며, 이는 다시 얻어진 조직에 온전한 흉막과 생존 가능한 주사 부위의 존재에 의해 영향을 받습니다. 이것은 설치류에서 달성하기가 간단한데, 아가로스가 기관을 통해 온전한 폐 내로 쉽게 유입될 수 있기 때문이다(27,28,29). 그러나 대형 동물 연구에서 실험에서 취한 생검은 일반적으로30,31을 캐뉼레이션할 수 있을 만큼 충분히 큰 기도가 없는 원위 폐 분절에서 이루어집니다. 따라서 기관지나 혈관에 아가로스를 주입하는 대신, 원산지 종이나 샘플 부피에 관계없이 폐 조직을 저융점 아가로스에 삽입하여 폐 조직 절편을 생성하는 이 방법을 채택합니다. 이 접근 방식은 기술적으로 더 쉬우며 가능한 한 조직 손상을 최소화하는 것을 목표로 합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 이 방법은 폐 조직 절편을 생성하는 데 더 높은 효율성과 용이성을 입증했습니다. 허파꽈리의 형태를 효과적으로 보존하고 특히 폐 조직 절단에 적합하여 반복 가능한 고해상도 다중 형광 이미징을 생성할 수 있습니다.
이 연구에서는 생성된 이미징 데이터에 대한 두 가지 샘플 기반 정량화를 추가로 보여줍니다. 첫 번째는 이미지 추적을 활용하여 종 샘플에 따른 폐포 크기의 차이를 평가했습니다. 당연히 쥐의 허파꽈리가 가장 작았고, 돼지와 인간의 허파꽈리는 크기가 비슷했기 때문에 돼지는 폐 연구를 위한 흥미로운 중개 모델로 부각되었습니다.
두 번째 정량화를 위해 성인과 유아 폐 샘플 간의 HTII 분포를 비교했습니다. 제2형 폐렴구는 원위 폐 상피의 구조에서 중요한 역할을 합니다. TII의 이러한 독특한 능력은 폐포 상피(32)의 복구 및 재생에 기여한다. 건강한 성인 인간의 폐에서 TII는 전체 세포 집단의 약 15%를 차지하는 반면, 폐포 표면적은 약 5%로 추정됩니다33. HTII-280은 폐포 상피세포의 발달 및 손상에 대한 반응을 연구하기 위해 널리 알려진 폐 특이적 마커이며, 특히 TII의 정점 원형질막에 국한되어 있습니다. 실험에서 성인 조직은 뇌내 출혈로 사망하고 동시에 폐 손상을 입은 기증 환자로부터 얻은 반면, 유아 샘플은 질식 관련 사망에서 얻은 것입니다. 연구 결과에 따르면 HTII-280의 발현은 유아 샘플보다 성인 폐 샘플에서 현저히 낮았습니다. 흥미롭게도, HTII-280은 대부분의 HTII에서 발현되지만, 그 발현은 조직의 질에 의해서도 영향을 받을 수 있으며, 손상된 인간 폐 조직에서는 현저하게 감소된다34. 노화된 폐 조직은 젊은 조직에 비해 TII의 수와 분비 활성이 현저히 감소하며, 노인 개인은 젊은 조직에 비해 TII의 증식, 분비 및 항세포사멸 활성이 상당히 낮다35. 이에 따라, 인간 TII에 특이적인 세포 표면 단백질의 식별 및 검출은 폐 손상의 중증도를 평가하고 폐 복구를 향상시키는 것을 목표로 하는 치료 접근법을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다36,37. 따라서 이 파이프라인을 활용하여 건강 및 질병의 더 큰 인간 코호트에서 폐포 TII 연구를 수행하는 것이 큰 관심사가 될 것입니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 폐 조직을 절단하는 더 빠르고 쉬운 접근 방식을 제시합니다. 이 방법은 폐 조직 준비, 절단 및 염색에 대한 자세한 지침을 제공하여 온전한 폐 조직 구조를 보존합니다. 건강한 폐 구조와 병든 폐 구조를 모두 연구하기 위한 모델을 최적화하여 실험 효율성을 향상시킵니다. 전반적으로, 이 연구는 종 전반에 걸친 폐 조직 병태생리학에서 복잡한 공간 생물학을 조사하기 위한 유망한 접근 방식을 도입하여 질병 및 복구에 작용하는 분자 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

생체 외 폐 조직 절편은 폐 질환 연구에 광범위하게 사용됩니다1. 특히 임상 및 중개 대동물 연구에서 현재의 황금 표준은 명시야 현미경 및 관찰자 기반 채점과 함께 헤마톡실린 및 에오신 염색을 사용하여 폐 기능 장애를 평가하고 등급을 매깁니다 2,3. 여전히 가치 있는 기술이지만 공간 해상도와 동시에 이미징할 수 있는 마커의 수 측면에서 한계가 있습니다. 더욱이, 폐 조직은 광범위한 용매 기반 세척을 거쳐야 하며, 이는 최종 이미징 전에 조직의 탈수, 수축 및 재수화를 초래한다4. 이 과정은 시간이 많이 걸릴 뿐만 아니라 환경 친화적이지 않고 단백질 에피토프를 가리며 구조적 조직 변화를 유발할 수 있습니다 5,6,7,8. 그러나 폐 조직의 경우 폐의 구조적 취약성으로 인해 절편 전에 파라핀을 삽입하는 것이 필요했습니다. 대조적으로, 뇌와 같은 고형 기관은 진동하는 마이크로톰(vibratome)을 사용하여 고정된 조직과 신선한 조직모두에서 절단할 수 있습니다 9,10,11,12.
폐 조직에서 진동 절편을 가능하게 하기 위해, 기도 또는 혈관을 통해 신선한 폐 조직에 낮은 융점 아가로스를 주입하고13,14를 응고시키기 위해 방치하는 정밀 절단 폐 절편(PCLS)이라는 방법이 확립되었습니다. 기도의 아가로스(agarose)는 비브라톰 절편(vibratome sectioning)을 허용하기에 충분한 구조적 지지를 제공한다 9,14. 설치류에서는, agarose가 기관을 통해 주사될 수 있기 때문에 달성하게 간단하다; 그러나, 돼지 및 인체 조직에서는 주어진 생검 내에서 적절한 기도/혈관을 찾는 것이 어려울 수 있다15,16. 더욱이, 그러한 기도/혈관이 위치하더라도, 아가로스를 주입하기 위해서는 일반적으로 상당한 힘이 필요하며, 이는 후속적인 폐 형태에 영향을 미칠 수 있다17.
파라핀 포매/절편/염색 및 PCLS 워크플로우에서 발생하는 문제를 극복하기 위해 당사는 고정된 폐 조직을 위한 새로운 처리 파이프라인을 구축했습니다. 이 워크플로우를 통해 절편에 진동을 사용할 수 있고, PCLS보다 더 얇은 슬라이스를 생성할 수 있으며, 다중 형광 이미징을 위해 항원 검색이 필요하지 않은 슬라이스를 생성할 수 있습니다. 이 방법은 고급 광학 현미경 검사에 사용할 수 있는 폐 절편을 생성하기 위한 "최소 처리" 수단을 제공합니다. 더욱이, 이미징 판독은 조직 18,19,20,21의 체적 구조를 캡처하여 폐 조직 내의 세포 및 해부학적 구조의 공간적 관계를 입증하는 데 사용할 수 있습니다. 이 논문은 이러한 폐 절편을 생성하는 프로토콜을 설명하고 이러한 각 조직에 적용되는 다중 염색과 이러한 고급 이미징 데이터를 정량화에 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture inserts</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3932.300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>SOLVECO</td>
			<td>6095714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>&#160;SARSTEDT</td>
			<td>2045221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cluster of differentiation 31 (CD31)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab23747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia X1000 Coverslip</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>10318963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td>FB395R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse 647&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit 568</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human type II cells</td>
			<td>Terrace Biotech</td>
			<td>TB-27AHT2-280&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Fluoromount-G Mounting Medium</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>E41473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1003467046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopersicon Esculentum lectin</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>2531965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>50-100-8798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cup</td>
			<td>kontorsgiganten</td>
			<td>885221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>STILLE</td>
			<td>101-8380-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth muscle actin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K54329188239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>LOCTITE</td>
			<td>2721643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated vibratome sectioning of agarose-embedded lung tissue for multiplex fluorescence imaging

내재된 구조적 취약성으로 인해 폐는 현미경 판독을 위해 처리하기 어려운 조직 중 하나로 간주됩니다. 절편을 위한 구조적 지지를 추가하기 위해 폐 조직 조각을 파라핀 또는 OCT 화합물에 삽입하고 각각 마이크로톰 또는 저온 유지 장치로 절단합니다. 정밀 절단 폐 절편으로 알려진 최신 기술은 아가로스 침윤을 통해 신선한 폐 조직에 구조적 지지를 추가하고 배양 시 1차 폐 조직을 유지할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 그러나 에피토프 마스킹(epitope masking) 및 조직 왜곡(tissue distortion)으로 인해 이러한 기술 중 어느 것도 여러 항체 및 종에 걸쳐 호환되는 재현 가능한 고급 광 이미징 판독 개발에는 적합하지 않습니다. 
이를 위해 우리는 자동화된 비브라톰 절편과 결합된 고정된 폐 조직의 아가로스 임베딩을 활용하는 조직 처리 파이프라인을 개발했습니다. 이를 통해 마우스, 돼지 및 인간의 폐에서 200μm에서 70μm 두께의 폐 절편 생성이 촉진되었으며, 이는 항원 회수가 필요하지 않으며 자연 분리 조직의 가장 적은 "처리된" 버전을 나타냅니다. 이러한 슬라이스를 사용하여 공간 단백질 발현을 사용하여 폐 손상 및 재생의 기전을 정량화하고 더 잘 이해할 수 있는 고해상도 이미지를 생성할 수 있는 다중 이미징 판독값을 공개합니다.

Ex vivo lung tissue slices are extensively used in the study of lung disease1. Current gold standards, particularly in clinical and translational large animal studies, employ hematoxylin and eosin staining coupled with brightfield microscopy and observer-based scoring to assess and grade lung dysfunction2,3. While still a valuable technique, it exhibits limitations in terms of spatial resolution and the number of markers that can be imaged simultaneously. Moreover, lung tissue is required to undergo extensive solvent-based washes, which results in dehydration, shrinkage, and rehydration of the tissue before its final imaging4. This process is not only time-consuming but is also environmentally unfriendly, masks protein epitopes, and may invoke structural tissue changes5,6,7,8. However, for lung tissue, embedding in paraffin prior to sectioning has been a necessity owing to the structural fragility of the lung. In contrast, solid organs such as the brain can be cut using a vibrating microtome (vibratome), both in fixed and fresh tissue9,10,11,12.
To enable vibratome sectioning in lung tissue, a method termed precision-cut lung slices&#160;(PCLS) was established where low melting point agarose is injected into fresh lung tissue via the airways or blood vessels and left to solidify13,14. The agarose in the airways provides sufficient structural support to then allow vibratome sectioning9,14. In rodents, this is simple to achieve as agarose can be injected via the trachea; however, in pig and human tissue, it can be challenging to locate a suitable airway/vessel within a given biopsy15,16. Moreover, even if such an airway/vessel is located, substantial force is usually required to inject the agarose, which may influence subsequent lung morphology17.
To overcome the challenges experienced in paraffin embedding/sectioning/staining and the PCLS workflow, we have established a new processing pipeline for fixed lung tissue. This workflow allows the use of a vibratome for sectioning, can produce thinner slices than in PCLS, and yields slices that do not require antigen retrieval for multiplex fluorescence imaging. This method offers a means of &#34;least processing&#34; to generate lung sections that can be used in advanced light microscopy. Moreover, imaging readouts can be used to demonstrate the spatial relationships of cells and anatomical structures within the lung tissue by capturing the volumetric architecture of the tissue18,19,20,21. This paper describes the protocol to generate these lung sections and demonstrates multiplex stains applied to each of these tissues and how these advanced imaging data can be used for quantification.

저자 스포트라이트: Agarose Embedded Lung Tissue Section을 사용한 공간 단백질 발현 연구 

다중 형광 이미징을 위한 Agarose-Embedded 폐 조직의 자동 진동 절편

This protocol is particularly useful in large animal models of lung transplantation and regeneration, such as pigs, where we can sample small pieces over time. This technique can help us better understand the spatial biology at play in these models. This technique produces minimally-processed lung slices suitable for immunofluorescence imaging without the need for antigen retrieval, and has been effective with all antibodies tested to date.This procedure can be adapted to cut slightly thicker sections, say around one millimeter, which can be then used in light sheet fluorescence microscopy to study the spatial protein expression in a more three-dimensional volume. Our research is investigating factors influencing lung transplant rejection, and developing therapies to reduce rejection using our pig model. This technique helps understand spatial protein changes affecting transplant outcomes post-surgery.We're currently using this technique to explore the spatial protein expression landscape in our pig lung transplant model. We hope that it will help us to better understand the mechanisms behind our experimental therapies. The key to succeeding here lies in vibratome sightings, high blade amplitudes, and lower force speeds are key things to look at if the sectioning goes badly.

폐 조직 절편을 생성하는 과정에는 준비, 삽입 및 절편을 포함한 몇 가지 주요 단계가 포함됩니다. 아가로스 용액(3%(w/v))은 1.5g의 저융점 아가로스를 50mL의 멸균 PBS에 용해시켜 만듭니다. 필요한 소모품에는 플라스틱 컵, 50mL 원뿔형 튜브의 뚜껑(테두리 제거), 집게, 가위가 포함됩니다. 폐 조직은 미세한 겸자와 멸균 가위로 조심스럽게 더 작은 블록으로 절제됩니다(그림 1A,B). 다음으로, 폐 조직 블록을 삽입하기 위해 컵의 바닥을 소량의 아가로스로 채우고 아가로스 표면에 뚜껑을 놓고 컵을 4°C에서 5분 동안 보관합니다(그림 1C). 약 1mL의 액체 아가로스를 뚜껑에 넣고 폐 조직 블록을 뚜껑에 놓습니다. 아가로스를 실온에서 반응고되도록 2-3분 동안 방치합니다(그림 1D). 폐 블록이 반고형화된 아가로스에 의해 제자리에 고정되면 폐 조직 블록이 완전히 잠길 때까지 액체 아가로스를 컵에 붓습니다. 이것은 4°C에서 15분 동안 보관됩니다(그림 1E,F). 저융점 아가로스 임베딩은 폐 조직에 필요한 지지력과 강성을 제공하여 슬라이싱 과정에서 원래 구조를 유지하는 데 도움이 됩니다. 날카로운 칼날은 폐 조직을 둘러싼 과도한 아가로스를 제거하는 데 사용됩니다. 조직 주위에 약 5mm 두께의 균일한 층이 남아 있습니다(그림 1G). 그런 다음 절제된 폐 조직 블록을 조직 홀더에 조심스럽게 붙입니다(그림 1H). 진동 버퍼 트레이는 PBS로 채워지고, 얼음은 주변 얼음 수조에 배치되고, 표본 디스크는 버퍼 트레이에 설치됩니다(그림 1I). 패널에 설정된 진동 절단 매개변수는 다음과 같습니다: 슬라이스 두께: 200μm; 주파수: 100Hz; 블레이드의 진폭 : 1.3mm; 블레이드의 전진 속도: 0.02-0.03mm/s, 조직 강성에 따라 다름(그림 1J). 마지막으로, 염색은 자유 부유 슬라이스에서 수행됩니다(그림 1K-M). 
면역형광 염색은 평활근 액틴(SMA, 평활근 세포 및 근섬유아세포 마커), 엘라스틴(세포외 기질 단백질) 및 기관지 폐포 상피 세포에 결합하는 Lycopersicon Esculentum lectin(LEA)에 대해 각 종의 200μm 절편에서 수행되었습니다. 폐는 구조적으로 이질적인 조직이므로 쥐, 돼지 및 인간의 폐포관, 혈관, 폐 내 세기관지 및 폐포를 포함한 구조 전반에 걸쳐 차등 SMA 및 엘라스틴 분포가 관찰됩니다(그림 2A-L). 세기관지 부피 20μm의 고해상도 렌더링은 폐 내의 미세 구조를 반3차원 수준에서 검사할 수 있는 방법을 보여줍니다(보충 비디오 S1). 정량적 예로, 이미지 추적을 활용하여 허파꽈리의 크기가 샘플(n = 20 허파꽈리) 간에 어떻게 다른지 보여줍니다(그림 2L,M).
이러한 고급 이미징 데이터를 정량적으로 활용하는 방법을 보여주기 위해 성인과 유아의 인간 폐 조직에서 제2형 폐세포(TII) 세포 분포를 비교했습니다. 인간 특이적 제2형 폐포 세포 항체인 HTII-280은 인간 제2형 세포의 표면에 강한 친화력을 가지고 있습니다(그림 3A-F). 이러한 세포는 체적 이미징을 사용하여 단일 폐포의 3차원 공간에서 추가로 볼 수 있습니다(보충 비디오 S2). 성인과 유아 샘플 간의 TII 수를 정량화하기 위해 10개의 무작위 시야(fov)에서 HTII-280 카운트를 처리했습니다. 이 샘플들 사이에서, 유아 샘플은 상당히 더 높은 TII 세포 수를 산출했습니다(그림 3G). 그러나 유아 샘플은 성인보다 훨씬 더 높은 스캐폴드 커버리지를 보였으며, 이는 더 높은 세포 수를 설명할 수 있습니다(그림 3H). 이를 설명하기 위해 우리는 조직mm2당 세포로서 스캐폴드 커버리지를 기반으로 TII의 수를 평가했으며, 이는 유아 샘플에서 여전히 훨씬 더 많은 수의 TII를 유지했습니다(그림 3I). 따라서 유아 샘플에서 TII 수가 더 높은 것은 스캐폴드 커버리지가 증가했기 때문이 아니며 전체 FOV가 아닌 스캐폴드 면적을 기준으로 폐의 세포 분포를 평가하는 것의 중요성을 강조합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65943/65943fig01.jpg"> 그림 1: 폐 조직 절편을 절단하기 위한 프로토콜. (A) 용액 및 재료: 1.5g의 저융점 아가로스를 50mL의 멸균 인산염-완충 식염수에 용해시켜 얻은 3%(w/v) 아가로스 용액; 플라스틱 컵; 50mL 코니컬 튜브의 뚜껑; 집게와 가위. (B) 미세한 집게와 멸균 가위를 사용하여 폐 조직을 절개하였다. (C) 컵의 바닥에 소량의 아가로스를 채우고 아가로스 표면에 뚜껑을 놓습니다. 그런 다음 4°C에서 5분 동안 보관합니다. (D) 1-2mL의 액체 아가로스를 뚜껑에 천천히 넣고 폐 조직 덩어리를 뚜껑에 조심스럽게 놓고 4°C에서 2분 동안 보관합니다. (E,F) 폐 조직 덩어리가 완전히 잠길 때까지 액체 아가로스를 컵에 붓고 4 °C에서 15 분 동안 보관하십시오. 그런 다음 플라스틱 컵을 부드럽게 깨뜨립니다. (G) 날카로운 칼날을 사용하여 폐 조직을 둘러싼 과도한 아가로스를 제거하고 조직 주위에 약 5mm 두께의 균일한 층을 남깁니다. (H) 절제된 폐 조직 블록을 조직 홀더에 조심스럽게 붙입니다. (I) 진동 버퍼 트레이에 PBS를 채우고 주변 얼음 수조에 얼음을 넣고 표본 디스크를 버퍼 트레이에 설치합니다. (J) 비브라톰 패널에 절단 매개변수를 설정합니다. 슬라이스 두께: 200μm, 주파수: 100Hz, 나이프 진폭: 1.3mm, 블레이드 전진 속도 0.02-0.04mm/s. (K-M) 여전히 아가로스에 내장되어 있고 면역형광 염색을 위해 준비된 자유 부유 슬라이스의 대표 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65943/65943fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65943/65943fig02.jpg"> 그림 2: 인간, 돼지 및 생쥐의 폐 구조에 대한 면역형광 이미지. (A-L) 각각 쥐, 돼지, 인간의 폐 조직 절편에서 폐포관, 혈관, 기관지, 폐포의 대표 이미지. SMA(녹색으로 표시)는 평활근 세포의 표지자이며 폐 조직의 혈관 및 기관지 벽에서 관찰됩니다. 엘라스틴(빨간색으로 표시)은 폐의 세포외 기질의 일부를 형성합니다. (M) 인간, 돼지 및 생쥐 샘플 모두에 대해 각 폐 조직 절편에서 20개의 무작위 위치를 선택하여 폐포 크기를 정량화합니다. 히스토그램은 각 그룹 내에서 폐포 크기의 분포를 설명하기 위해 활용되었습니다. 스케일 바 = 50μm(AF, HL), 100μm(G). Kruskall-Wallis 검정. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 약어: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; LEA = Lycopersicon Esculentum 렉틴; SMA = 평활근 액틴; ms = 마우스; hmn = 인간. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65943/65943fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65943/65943fig03.jpg"> 그림 3. 인간 성인 및 유아 샘플의 유형 2 폐렴구 분포. (ᅡ,ᄂ) HTII-280(빨간색으로 표시), CD31(녹색으로 표시) 및 LEA(회색으로 표시)로 염색된 성인 및 유아 인간 폐 조직의 대표 이미지. (씨,디) 제2형 폐구 분포만을 보여주는 성인 및 유아의 대표 이미지. (이,에프) 성인 및 유아 인간 폐 샘플에서 추출한 개별 제2형 폐세포의 단일 세포 분해능 대표 이미지. (G) 성인과 유아 샘플 사이의 제2형 폐렴구 수의 정량화. (H) 성인 및 유아 샘플에서 폐 조직 지지체 영역 범위(공기 대비 %)의 정량화. (I) 성인 및 유아 샘플에서 조직의mm2당 유형 2 폐구의 정량화. 스케일 바 = 5 μm (E,F), 100 μm (A-D). n = 샘플당 10 FOV. 쌍을 이루지 않은 t-검정 또는 Mann-Whitney 검정. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 약어: DAPI = 4', 6-디아미디노-2-페닐린돌; LEA = Lycopersicon Esculentum 렉틴; HTII = 인간 II형 세포; CD31 = 혈소판 내피 세포 접착 분자-1/분화 클러스터 31; FOV = 시야. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65943/65943fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 S1: DAPI, LEA, SMA 및 엘라스틴을 사용하여 염색한 단일 돼지 기도의 20μm 이미징 부피 비디오는 기도 벽 요소의 구조에 대한 고해상도 보기를 보여줍니다. 약어: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; LEA = Lycopersicon Esculentum 렉틴; SMA = 평활근 액틴. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65943/Sup_vid1.mp4" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 S2: DAPI, LEA 및 HTII-280을 사용하여 염색된 단일 폐포의 30μm 이미징 부피 비디오는 구조 전반에 걸친 제2형 폐포구 분포를 보여줍니다. 약어: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; LEA = Lycopersicon Esculentum 렉틴; SMA = 평활근 액틴. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65943/Sup_vid2.mp4" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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우리는 비브라톰과 아가로스 포매된 폐 조직을 활용하여 폐 절편을 생성하는 조직 처리 기술을 개발하여 폐 구조의 고해상도 이미지를 획득할 수 있습니다. 특정 폐 구조 마커를 사용하여 공간 단백질 발현을 관찰하기 위해 면역형광 염색을 사용했습니다.

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural ...

이 프로토콜은 시간이 지남에 따라 작은 조각을 샘플링할 수 있는 돼지와 같은 폐 이식 및 재생의 대형 동물 모델에 특히 유용합니다. 이 기술은 이러한 모델에서 작동하는 공간 생물학을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 항원 채취 없이 면역형광 이미징에 적합한 최소한으로 처리된 폐 절편을 생성하며, 현재까지 테스트된 모든 항체에 효과적입니다.이 절차는 약 1mm와 같이 약간 더 두꺼운 부분을 절단하는 데 적용할 수 있으며, 이는 광시트 형광 현미경 검사에 사용되어 보다 3차원 부피의 공간 단백질 발현을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 연구는 폐 이식 거부 반응에 영향을 미치는 요인을 조사하고 돼지 모델을 사용하여 거부 반응을 줄이는 치료법을 개발하고 있습니다. 이 기술은 수술 후 이식 결과에 영향을 미치는 공간 단백질 변화를 이해하는 데 도움이 됩니다.우리는 현재 이 기술을 사용하여 돼지 폐 이식 모델에서 공간 단백질 발현 환경을 탐색하고 있습니다. 우리는 그것이 우리의 실험적 치료법의 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움이 되기를 바랍니다. 여기서 성공의 열쇠는 비브라톰 관찰, 높은 블레이드 진폭, 낮은 힘 속도에 있으며 절편이 나빠질 경우 살펴봐야 할 핵심 사항입니다.

automated-vibratome-sectioning-agarose-embedded-lung-tissue-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging

2.6K 조회수.  Lund University. 이 프로토콜은 시간이 지남에 따라 작은 조각을 샘플링할 수 있는 돼지와 같은 폐 이식 및 재생의 대형 동물 모델에 특히 유용합니다. 이 기술은 이러한 모델에서 작동하는 공간 생물학을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 항원 채취 없이 면역형광 이미징에 적합한 최소한으로 처리된 폐 절편을 생성하며, 현재까지 테스트된 모든 항체에 효과적입니다.

비디오: 저자 스포트라이트: Agarose Embedded Lung Tissue Section을 사용한 공간 단백질 발현 연구 

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural support for sectioning, pieces of lung tissue are commonly embedded in paraffin or OCT compound and cut with a microtome or cryostat, respectively. A more recent technique, known as precision-cut lung slices, adds structural support to fresh lung tissue through agarose infiltration and provides a platform to maintain primary lung tissue in culture. However, due to epitope masking and tissue distortion, none of these techniques adequately lend themselves to the development of reproducible advanced light imaging readouts that would be compatible across multiple antibodies and species. 
To this end, we have developed a tissue-processing pipeline, which utilizes agarose embedding of fixed lung tissue, coupled to automated vibratome sectioning. This facilitated the generation of lung sections from 200 &#181;m to 70 &#181;m thick, in mouse, pig, and human lungs, which require no antigen retrieval, and represent the least "processed" version of the native isolated tissue. Using these slices, we reveal a multiplex imaging readout capable of generating high-resolution images whose spatial protein expression can be used to quantify and better understand the mechanisms underlying lung injury and regeneration.

We have developed a tissue-processing technique utilizing a vibratome and agarose-embedded lung tissue to generate lung sections, thereby permitting the acquisition of high-resolution images of lung architecture. We employed immunofluorescence staining to observe spatial protein expression using specific lung structural markers.

연구

의학

Agarose Embedding of Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging

To begin, fix the porcine lung tissue in 4%paraformaldehyde at room temperature for 48 hours. Then transfer the lung tissue to a 50 milliliter conical tube containing 30 milliliters of PBS with 0.01%Sodium Azide. Keep a plastic cup fine forceps and sterile scissors ready.Heat the agarose in a microwave until it reaches boiling point. Then cool it down to 42 degrees Celsius in a water bath. Store it in the water bath until ready for use.Remove the lung biopsy from the PBS Azide solution. Use fine forceps and sterile scissors to carefully dissect the lung lobes into smaller blocks. Next, cut down the middle of a plastic cup.Pour a small amount of agarose at the bottom of the cup. Place the lid of a 50 milliliter conical tube with its rim removed on the agaro surface. Store this set up at four degrees Celsius for five minutes to allow the agarose to solidify.Once the agarose has solidified, remove the plastic cup from the refrigerator. Now pour about one milliliter of liquid agarose onto the lid. Then gently place the lung tissue block on the lid.Once the agarose has semis solidified, slowly submerged the lung tissue in liquid agarose. Refrigerate the setup at four degrees Celsius for about 15 minutes until the agarose becomes solid. Use a sharp blade to carefully remove any excess agarose surrounding the lung tissue.

Agarose Embedding of Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging(다중 형광 이미징을 위한 폐 조직의 아가로스 임베딩)

Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue

To begin, embed the lung tissue in agarose. To prepare the lung tissue for sectioning, first, attach each tissue block to the specimen disc of the vibratome with super glue and add ice to the surrounding bath. Then carefully install the specimen disc into the buffer tray and fill the tray with PBS.Next, set the vibratome parameters, keeping the thickness at 200 micrometers, the frequency at 100 hertz, the amplitude of the blade at 1.3 millimeters, and the forward speed of the blade between 0.02 and 0.03 millimeters per second. Commence the sectioning of the lung tissue. Once enough slices have been created, use a brush to gently lift the tissue slice from the vibratome tray.Transfer the slices to a 24 well plate with PBS azide solution. Preserve the lung slices at four degrees Celsius.

아가로스에 포매된 폐 조직의 진동 절편

Immunostaining of Agarose-Embedded Lung Tissue Sections

Begin by embedding lung tissue and agarose and sectioning it using a vibratome. To the sliced tissues, add 300 microliters of the blocking agent. Incubate the plate at four degrees Celsius on a shaker with gentle agitation for 45 minutes.Next, pipette 300 microliters of the PBS diluted primary antibody into each well. Incubate the plate overnight at four degrees Celsius with gentle shaking. Now gently pipette out the primary antibodies without touching the slice.Wash the slices three times with 400 microliters of PBS. Next, pipette 300 microliters of the dilute secondary antibodies into each well. Remove the antibody solution after cold incubation for 90 minutes.Then add the DAPI and tomato lectin 488 to the wells. Incubate the mixture for 30 minutes. After removing DAPI and tomato lectin, wash the slices in PBS for three cycles of 10 minutes.With a brush, transfer the slices to a slide. Place three drops of mounting medium on the slide and mount a cover slip over it before imaging. The lung sections of mouse, pig, and human samples were immunofluorescently stained for SMA, elastin, and LEA.The SMA and elastin were observed to be distributed across structures such as alveolar ducts, blood vessels, bronchioles, and alveoli. Comparison of type II pneumocytes distribution in adult and infant humans was performed. The type II alveolar cell antibody HT2-280 had a strong affinity to the pneumocytes cell surface.The infant sample yielded a significantly higher type II pneumocytes count. However, the infant sample also exhibited a significantly higher scaffold coverage than the adult. The number of type II pneumocytes based on scaffold coverage was also significantly higher in the infants.