המחברים מודים בהכרת תודה על המימון שהתקבל מקרן וולנברג לרפואה מולקולרית וממרכז תאי גזע באוניברסיטת לונד ומודים למרכז ההדמיה הביולוגית של אוניברסיטת לונד (LBIC) על הגישה ל-Nikon A1RHD.

ריאות עכבר נתרמו על ידי חוקרים באמצעות מערכות איברים אחרות במאמץ לקיים את 3Rs. כל ההליכים בחזירים בוצעו בהתאם לדירקטיבה האירופית 2010/63/EU ואושרו על ידי הוועדה האתית לחקר בעלי חיים במאלמו-לונד (Dnr 5.8.18-05527/2019) ונערכו בהתאם להנחיות CODEX של מועצת המחקר השבדית. אישור לשימוש בדגימות אנושיות ניתן על ידי ועדת האתיקה הלאומית השבדית (Dnr 2020-07115 ו- Dnr 2020-01864). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת פתרונות וחומרים
<ol><li>תקן את רקמת הריאה ב 4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך 48 שעות. לאחר מכן, להעביר את רקמת הריאה לצינור חרוטי 50 מ"ל מלא במי מלח חוצצים פוספט (PBS) המכיל 0.01% נתרן אזיד.</li>
	<li>הכינו תמיסת אגרוז 3% (w/v) על ידי המסת 1.5 גרם של אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה ב-50 מ"ל של PBS סטרילי. הכינו פלסטיק, מלקחיים עדינים ומספריים סטריליים.</li>
	<li>מחממים את האגרוז במיקרוגל עד שהוא רותח, ואז מקררים אותו ל 42 מעלות צלזיוס באמבט מים. שמור את האגרוז בצורתו הנוזלית על ידי אחסונו, באמבט המים עד שיהיה מוכן לשימוש. הערה: בעת חימום האגרוז, צפו במיקרוגל עד שהוא מתחיל לרתוח כדי שלא יעלה על גדותיו. זה בדרך כלל לוקח בערך 1.5 דקות.</li>
</ol>2. רקמת ריאה משובצת באגרוז
<ol><li>הרימו את ביופסיית הריאה מה-PBS-azide ונתחו בזהירות את אונות הריאה בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים סטריליים. חתכו את אונת הריאה לגושים קטנים יותר. הערה: בעוד חתך עם הצדר אפשרי, צרורות אלסטין עבים שלה יכול לעכב חיתוך עם להב ויברטום. לכן, אנו ממליצים על הסרתו אם אין צורך.</li>
	<li>חותכים פלסטיק באמצע ומוסיפים כמות קטנה של אגרוז לתחתיתה. מניחים את המכסה מצינור חרוטי 50 מ"ל (השפה מוסרת) על פני האגרוז ומאחסנים את הכוס ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לאפשר לאגרוז להתמצק לשימוש מאוחר יותר.</li>
	<li>מוציאים את הפלסטיק מהמקרר בטמפרטורה 4°C, מוסיפים כ-1 מ"ל של אגרוז נוזלי על המכסה, ואז מניחים בעדינות את בלוק רקמת הריאה על המכסה. השאירו את האגרוז למשך 2-3 דקות כדי להתמצק למחצה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשפוך לאט את agarose נוזלי על רקמת הריאה עד שהוא שקוע לחלוטין.</li>
	<li>מכניסים למקרר ל-4°C למשך כ-15 דקות עד שהאגרוז מתמצק. לאחר מכן, השתמשו בזהירות בלהב חד כדי להסיר אגרוז נוסף סביב רקמת הריאה, והשאירו שכבה אחידה בעובי של כ-5 מ"מ סביב הרקמה (איור 1).</li>
</ol>3. חיתוך קטעי רקמת ריאה
<ol><li>כדי להכין את רקמת הריאה לחתך, חברו כל בלוק רקמה לדיסק הדגימה של הוויברטומה באמצעות דבק על. לאחר מכן, מלאו את מגש חיץ הוויברטום ב-PBS והניחו קרח באמבט הקרח שמסביב. לבסוף, התקן בזהירות את דיסק הדגימה במגש החיץ.</li>
	<li>פורסים את רקמת הריאה עם הוויברטומה עם ההגדרות הבאות: עובי: 200 מיקרומטר, תדירות: 100 הרץ, משרעת הלהב: 1.3 מ"מ, ומהירות קדימה של הלהב של 0.02-0.03 מ"מ לשנייה, התלויה בנוקשות הרקמות. הערה: חיתוך אפשרי עד לעובי של 70 מיקרומטר אם מהירות הלהב מופחתת ל-0.01 מ"מ לשנייה. ויברטומים מסוימים (למשל, Leica V1200s) מאפשרים אוטומציה של חתכים על ידי הגדרת חלון חיתוך.</li>
	<li>כדי לאסוף חלקים, העבירו בעדינות את פרוסת הטישו על ידי גריפה עם מברשת ממגש הוויברטום לצלחת של 24 בארות מלאה ב-0.01% אזיד ב-PBS. לבסוף, לשמר את פרוסות הריאה ב 4 °C (75 °F).</li>
</ol>4. אימונוסטיין של אלסטין, CD31, HTII-280 ו-SMA
<ol><li>יש לחדור ולחסום (אלבומין בסרום בקר 1% + 0.5% טריטון + 5% סרום עיזים רגיל) את הרקמה ב-4°C תחת ניעור עדין למשך 45 דקות.</li>
	<li>לדלל את הנוגדנים הראשוניים (SMA 1:500; אלסטין 1:250; CD31 1:250; HTII-280 1:250) ב-PBS, יש להוסיף 300 μL לכל באר, ולדגור למשך הלילה ב-4°C תחת ניעור עדין.</li>
	<li>מבלי לגעת בפרוסה ולהסיר את הנוגדנים הראשוניים עם קצה פיפטה, יש לשטוף 3 x 20 דקות (400 μL) עם PBS.</li>
	<li>לדלל את הנוגדנים המשניים (1:1000) ב- PBS, להוסיף 300 μL לכל באר, ולדגור ב 4 ° C תחת ניעור עדין במשך 90 דקות.</li>
	<li>הסר את הנוגדנים המשניים עם קצה פיפטה, הוסף 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1:1000) ועגבניות lectin-488 (1:500) עבור דגירה של 30 דקות, ושטף במשך 3 x 10 דקות עם PBS.</li>
	<li>הניחו שלוש טיפות של אמצעי הרכבה על השקופית, הרכיבו מכסה והמשיכו להדמיה.</li>
</ol>

הדמיית ריאות חדשנית באמצעות קטעי ויברטום משובצים באגרוז

<ol>
	<li>Morin, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+in+vitro+lung+physio-pharmacotoxicology+studies.">Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies.</a> Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).</li><li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NanoSuit+method:+a+novel+histological+approach+for+examining+paraffin+sections+in+a+nondestructive+manner+by+correlative+light+and+electron+microscopy.">The NanoSuit method: a novel histological approach for examining paraffin sections in a nondestructive manner by correlative light and electron microscopy.</a> Laboratory Investigation. 100 (1), 161-173 (2020).</li><li>Silva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Semi-quantitative+scoring+system+for+green+histopathological+evaluation+of+large+animal+models+of+acute+lung+injury.">A Semi-quantitative scoring system for green histopathological evaluation of large animal models of acute lung injury.</a> BIO-PROTOCOL. 12 (16), e4493 (2022).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+tissue-clearing+conditions+based+on+analysis+of+the+critical+factors+affecting+tissue-clearing+procedures.">Optimizing tissue-clearing conditions based on analysis of the critical factors affecting tissue-clearing procedures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12815 (2018).</li><li>Jain, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry+for+predictive+biomarker+testing+in+lung+cancer+cytology.">Immunocytochemistry for predictive biomarker testing in lung cancer cytology.</a> Cancer Cytopathology. 127 (5), 325-339 (2019).</li><li>Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+stains:+a+literature+review+and+case+study.">Histological stains: a literature review and case study.</a> Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2015).</li><li>Morrison, L. E., Lefever, M. R., Lewis, H. N., Kapadia, M. J., Bauer, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+histological+and+cytological+staining+with+simultaneous+immunohistochemistry+enabled+by+invisible+chromogens.">Conventional histological and cytological staining with simultaneous immunohistochemistry enabled by invisible chromogens.</a> Laboratory Investigation. 102 (5), 545-553 (2022).</li><li>Dineshshankar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kerosene+as+an+alternative+to+xylene+in+histopathological+tissue+processing+and+staining:+An+experimental+study.">Kerosene as an alternative to xylene in histopathological tissue processing and staining: An experimental study.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11 (6), 376 (2019).</li><li>Abdelaal, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+vibratome+and+compresstome+sectioning+of+fresh+primate+lymphoid+and+genital+tissues+for+in+situ+MHC-tetramer+and+immunofluorescence+staining.">Comparison of vibratome and compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining.</a> Biological Procedures Online. 17 (1), 2 (2015).</li><li>Siwczak, F., Hiller, C., Pfannkuche, H., Schneider, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+vibrating+microtome+tissue+slices+as+a+3D+model+in+biomedical+research.">Culture of vibrating microtome tissue slices as a 3D model in biomedical research.</a> Journal of Biological Engineering. 17 (1), 36 (2023).</li><li>B&#232;chet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glymphatic+pathways+in+the+gyrencephalic+brain.">Glymphatic pathways in the gyrencephalic brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 41 (9), 2264-2279 (2021).</li><li>B&#232;chet, N. B., Kylkilahti, T. M., Mattsson, B., Petrasova, M., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy+of+optically+cleared+brains+for+studying+the+glymphatic+system.">Light sheet fluorescence microscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).</li><li>Bai, Y., Ai, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+the+precision-cut+lung+slice+to+study+the+contractile+regulation+of+airway+and+intrapulmonary+arterial+smooth+muscle.">Utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (183), (2022).</li><li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+(3D-LTCs)+for+disease+modeling.">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology &amp; Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Lam, M., Lamanna, E., Organ, L., Donovan, C., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+precision+cut+lung+slices&#8212;powerful+tools+for+investigation+of+mechanisms+and+therapeutic+targets+in+lung+diseases.">Perspectives on precision cut lung slices&#8212;powerful tools for investigation of mechanisms and therapeutic targets in lung diseases.</a> Frontiers in Pharmacology. 14, 1162889 (2023).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology.">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).</li><li>Cooper, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formoterol+and+salmeterol+induce+a+similar+degree+of+&#946;+2-+adrenoceptor+tolerance+in+human+small+airways+but+via+different+mechanisms.">Formoterol and salmeterol induce a similar degree of &#946; 2- adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms.</a> British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).</li><li>Ochoa, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+murine+whole+lung+fibrosis+by+large+scale+3D+microscopy+aided+by+tissue+optical+clearing.">Imaging of murine whole lung fibrosis by large scale 3D microscopy aided by tissue optical clearing.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13348 (2018).</li><li>Tehrani, K. F., Park, J., Chaney, E. J., Tu, H., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+imaging+histopathology:+a+pipeline+to+correlate+gold-standard+hematoxylin+and+eosin+staining+with+modern+nonlinear+microscopy.">Nonlinear imaging histopathology: a pipeline to correlate gold-standard hematoxylin and eosin staining with modern nonlinear microscopy.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 29 (4), (2023).</li><li>Branchfield, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+study+of+alveologenesis+in+mouse+lung.">A three-dimensional study of alveologenesis in mouse lung.</a> Developmental Biology. 409 (2), 429-441 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+vibratome+for+high-speed+ultrathin+biotissue+cutting+and+organ-wide+imaging.">Precision vibratome for high-speed ultrathin biotissue cutting and organ-wide imaging.</a> iScience. 24 (9), 103016 (2021).</li><li>Qian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOCK2+promotes+pleural+fibrosis+by+modulating+mesothelial+to+mesenchymal+transition.">DOCK2 promotes pleural fibrosis by modulating mesothelial to mesenchymal transition.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), 171-182 (2022).</li><li>Cagle, P. T., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+the+pleura:+What+the+pulmonologists+need+to+know.">Pathology of the pleura: What the pulmonologists need to know.</a> Respirology. 16 (3), 430-438 (2011).</li><li>Jantz, M. A., Antony, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleural+fibrosis.">Pleural fibrosis.</a> Clinics in Chest Medicine. 27 (2), 181-191 (2006).</li><li>Viana, F., O&#8217;Kane, C. M., Schroeder, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+lung+slices:+A+powerful+ex+vivo+model+to+investigate+respiratory+infectious+diseases.">Precision-cut lung slices: A powerful ex vivo model to investigate respiratory infectious diseases.</a> Molecular Microbiology. 117 (3), 578-588 (2022).</li><li>Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Videomorphometric+analysis+of+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+of+intra-pulmonary+arteries+using+murine+precision+cut+lung+slices.">Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e50970 (2014).</li><li>Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+mouse+lung+slices+to+visualize+live+pulmonary+dendritic+cells.">Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55465 (2017).</li><li>Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+ex+vivo+pulmonary+vessel+structure+and+contractility+studies.">Precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62392 (2021).</li><li>Ghaidan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+primary+graft+dysfunction+using+cytokine+adsorption+during+organ+preservation+and+after+lung+transplantation.">Reduction of primary graft dysfunction using cytokine adsorption during organ preservation and after lung transplantation.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li><li>Guenthart, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+severely+damaged+lungs+using+an+interventional+cross-circulation+platform.">Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform.</a> Nature Communications. 10 (1), 1985 (1985).</li><li>Ruaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+mystery+of+alveolar+epithelial+type+II+cells:+focus+on+their+physiologic+and+pathologic+role+in+lung.">The history and mystery of alveolar epithelial type II cells: focus on their physiologic and pathologic role in lung.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2566 (2021).</li><li>Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+number+and+cell+characteristics+of+the+normal+human+lung.">Cell number and cell characteristics of the normal human lung.</a> The American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).</li><li>Evans, K. V., Lee, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+wars:+The+rise+of+in+vitro+models+to+understand+human+lung+alveolar+maintenance,+regeneration,+and+disease.">Alveolar wars: The rise of in vitro models to understand human lung alveolar maintenance, regeneration, and disease.</a> Stem Cells Translational Medicine. 9 (8), 867-881 (2020).</li><li>Chen, J. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirtuin+3+ameliorates+lung+senescence+and+improves+type+II+alveolar+epithelial+cell+function+by+enhancing+the+FoxO3a-dependent+antioxidant+defense+mechanism.">Sirtuin 3 ameliorates lung senescence and improves type II alveolar epithelial cell function by enhancing the FoxO3a-dependent antioxidant defense mechanism.</a> Stem Cells and Development. 30 (17), 843-855 (2021).</li><li>Zacharias, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+lung+alveolus+by+an+evolutionarily+conserved+epithelial+progenitor.">Regeneration of the lung alveolus by an evolutionarily conserved epithelial progenitor.</a> Nature. 555 (7695), 251-255 (2018).</li><li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTII-280,+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells.">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטה משופרת מבוססת ויברטומים ליצירת קטעי ריאה. בהשוואה לטכניקות עיבוד מבוססות פרפין, שיטה זו חסכונית יותר, חסכונית יותר בזמן וטובה יותר לסביבה22. יתר על כן, שיטה זו מסייעת לשמור על שלמות המבנה של פרוסות רקמת הריאה ומאפשרת הדמיה אימונופלואורסצנטית מתקדמת ללא צורך בשליפת אנטיגן. עם זאת, במהלך הניסויים שלנו, מצאנו גם מגבלות מסוימות לזרימת העבודה הזו. ריאות חולות יכולות להפריע לתהליך החיתוך עקב הרס רקמות הנגרם על ידי שינויים פתולוגיים. בעת שימוש בויברטומה לחיתוך, חסימות דרכי הנשימה ורקמת ריאה פיברוטית חמורה יכולות לעכב את הלהב, מה שהופך את תהליך חיתוך רקמות אלה למאתגר יותר. עם זאת, ניתן להתגבר על כך על ידי הפחתת מהירות הלהב ותמיכה ברקמה עם מברשת צבע עדינה. אתגרים דומים נובעים מהתעבות הצדר, שהיא תוצאה שכיחה בדלקת ריאות, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) ופיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF)23,24,25. אם הצדר אינו מעניין לניסוי, אנו ממליצים להסיר אותו לפני החתך או על ידי בידוד נפח ריאה הרחק מהצדר. אם הצדר נחוץ, ניתן לחתוך אותו באמצעות מניפולציה דומה לזו שלעיל, הכוללת מהירויות להב איטיות יותר ותמיכה בפרוסה ממברשת עדינה.
בעוד פרוסות ריאה חתוכות במדויק יכולות לשמר את הארכיטקטורה התלת-ממדית והסביבה הטבעית של הריאה26, חשוב לציין כי יצירת PCLS היא תהליך מורכב וגוזל זמן. ההצלחה של יצירת פרוסות רקמת הריאה תלויה מאוד ביעילות של מילוי agarose, אשר, בתורו, מושפע על ידי נוכחות של צדר שלם אתרי הזרקה קיימא ברקמה המתקבלת. זה פשוט להשגה במכרסמים כמו agarose יכול בקלות להיות מוכנס דרך קנה הנשימה לתוך ריאות שלמות27,28,29. עם זאת, במחקר בבעלי חיים גדולים, ביופסיות שנלקחות בניסוי הן בדרך כלל ממקטעי ריאות דיסטליים, אשר חסרים נתיב אוויר גדול מספיק כדי לקנן30,31. לכן, במקום להזריק אגרוז לסימפונות או לכלי הדם, אנו מאמצים שיטה זו שבה רקמת הריאה, ללא קשר למין המקור או נפח הדגימה, מוטמעת באגרוז בנקודת התכה נמוכה כדי ליצור פרוסות רקמת ריאה. גישה זו קלה יותר מבחינה טכנית ומטרתה למזער את הנזק לרקמות ככל האפשר. בהתבסס על הניסיון שלנו, שיטה זו הוכיחה יעילות גבוהה יותר וקלות ביצירת קטעי רקמת ריאה. הוא משמר ביעילות את המורפולוגיה של הנאדיות ומתאים במיוחד לחיתוך רקמת ריאה, ומאפשר יצירת הדמיה פלואורסצנטית רב-תכליתית ברזולוציה גבוהה הניתנת לחזרה.
במחקר זה, אנו מדגימים גם שני כימות מבוסס מדגם עבור נתוני ההדמיה שנוצרו. הראשון השתמש במעקב אחר תמונות כדי להעריך הבדלים בגודל הנאדיות בין דגימות מינים. באופן לא מפתיע, נאדיות עכברים היו הקטנות ביותר, בעוד נאדיות חזיר ונאדיות אנושיות היו דומות בגודלן, מה שהדגיש חזירים כמודל תרגום מעניין לחקר ריאות.
לצורך הכימות השני, השווינו את התפלגות HTII בין דגימת ריאות של מבוגרים לתינוקות. פנאומוציטים מסוג 2 ממלאים תפקיד חיוני במבנה אפיתל הריאה הדיסטלי. יכולת ייחודית זו של TIIs תורמת לתיקון והתחדשות של אפיתל מכתשית32. בריאה האנושית הבוגרת והבריאה, TIIs מהווים כ-15% מכלל אוכלוסיית התאים, בעוד שהכיסוי שלהם של שטח הפנים של הנאדיות מוערך בכ-5%33. HTII-280 הוא סמן ספציפי לריאות מוכר לחקר ההתפתחות והתגובה של תאי אפיתל בנאדיות לפציעה, והוא ממוקם באופן ספציפי לקרומי הפלזמה האפיקליים של TIIs. בניסוי התקבלה רקמה בוגרת מתורם שנפטר עקב דימום תוך-מוחי וסבל מפגיעה ריאתית במקביל, ואילו דגימת התינוק הגיעה מתמותה הקשורה לחנק. הממצאים שלנו מצביעים על כך שהביטוי של HTII-280 היה נמוך משמעותית בדגימת הריאה הבוגרת מאשר בדגימת התינוקות. מעניין לציין כי בעוד HTII-280 מתבטא ברוב HTIIs, הביטוי שלו יכול להיות מושפע גם מאיכות הרקמות, והוא מופחת באופן משמעותי ברקמת הריאה האנושית הפגועה34. רקמות ריאה מזדקנות מציגות ירידה משמעותית במספר ובפעילות ההפרשה של TII בהשוואה לרקמות צעירות, ואנשים מבוגרים מפגינים התפשטות, הפרשה ופעילות אנטי-אפופטוטית נמוכה משמעותית של TII בהשוואה לרקמות צעירות35. בהתאם לכך, זיהוי וזיהוי של חלבון פנים-תא ספציפי ל-TIIs אנושיים יכול לסייע בהערכת חומרת הפגיעה הריאה ובהערכת גישות טיפול שמטרתן לשפר את תיקון הריאות36,37. לכן, באמצעות צינור זה, יהיה זה עניין רב לערוך מחקרי TII בנאדיות בקבוצות אנושיות גדולות יותר של בריאות ומחלות.
לסיכום, פרוטוקול זה מציג גישה מהירה וקלה יותר לחיתוך רקמת ריאה. שיטה זו מספקת הוראות מפורטות להכנת רקמת הריאה, חיתוך וצביעה, ומבטיחה שמירה על מבנה רקמת הריאה השלם. הוא מייעל את המודל לחקר ארכיטקטורת ריאות בריאות וחולות כאחד, מה שמוביל לשיפור יעילות הניסוי. בסך הכל, מחקר זה מציג גישה מבטיחה לחקר ביולוגיה מרחבית מורכבת בפתופיזיולוגיה של רקמת ריאה בין מינים, אשר יכולה לסייע בהבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים הפועלים במחלות ובתיקון.

פרוסות רקמת ריאה Ex vivo נמצאות בשימוש נרחב במחקר של מחלת ריאות1. תקני הזהב הנוכחיים, במיוחד במחקרים קליניים ותרגומיים בבעלי חיים גדולים, משתמשים בהמטוקסילין ובצביעת אאוזין בשילוב עם מיקרוסקופ ברייטפילד וניקוד מבוסס צופה כדי להעריך ולדרג תפקוד ריאות 2,3. למרות שהיא עדיין טכניקה בעלת ערך, היא מציגה מגבלות במונחים של רזולוציה מרחבית ומספר הסמנים שניתן לצלם בו זמנית. יתר על כן, רקמת הריאה נדרשת לעבור שטיפות נרחבות על בסיס ממס, מה שגורם להתייבשות, התכווצות והתייבשות מחדש של הרקמה לפני ההדמיה הסופיתשלה 4. תהליך זה לא רק גוזל זמן אלא גם אינו ידידותי לסביבה, מסווה אפיטופים של חלבונים, ועלול לעורר שינויים מבנייםברקמה 5,6,7,8. עם זאת, עבור רקמת ריאה, הטבעה בפרפין לפני חתך היה הכרח בשל השבריריות המבנית של הריאה. לעומת זאת, איברים מוצקים כמו המוח ניתנים לחיתוך באמצעות מיקרוטום רוטט (ויברטום), הן ברקמה קבועה והן ברקמה טרייה 9,10,11,12.
כדי לאפשר חתך ויברטומי ברקמת ריאה, נקבעה שיטה המכונה פרוסות ריאה חתוכות בדיוק (PCLS) שבה נקודת התכה נמוכה מוזרקת לרקמת ריאה טרייה דרך דרכי הנשימה או כלי הדם ומשאירה להתמצק13,14. האגרוז בדרכי הנשימה מספק תמיכה מבנית מספקת כדי לאפשר חתך ויברטומי 9,14. במכרסמים, זה פשוט להשגה כמו agarose ניתן להזריק דרך קנה הנשימה; עם זאת, ברקמת חזיר ואדם, זה יכול להיות מאתגר לאתר נתיב אוויר / כלי מתאים בתוך ביופסיה נתונה15,16. יתר על כן, גם אם נמצא נתיב אוויר/כלי שיט כזה, נדרש בדרך כלל כוח משמעותי כדי להזריק את האגרוז, מה שעשוי להשפיע על מורפולוגיית הריאה הבאה17.
כדי להתגבר על האתגרים המנוסים בהטבעה / חתך / צביעה של פרפין וזרימת העבודה של PCLS, הקמנו צינור עיבוד חדש לרקמת ריאה קבועה. תהליך עבודה זה מאפשר שימוש בויברטום לחיתוך, יכול לייצר פרוסות דקות יותר מאשר ב- PCLS, ומניב פרוסות שאינן דורשות שליפת אנטיגן להדמיית פלואורסצנטיות מרובה. שיטה זו מציעה אמצעי של "עיבוד מינימלי" ליצירת קטעי ריאות שניתן להשתמש בהם במיקרוסקופ אור מתקדם. יתר על כן, ניתן להשתמש בקריאות הדמיה כדי להדגים את היחסים המרחביים של תאים ומבנים אנטומיים בתוך רקמת הריאה על ידי לכידת הארכיטקטורה הנפחית של הרקמה 18,19,20,21. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול ליצירת מקטעי ריאה אלה ומדגים כתמים מרובים המיושמים על כל אחת מהרקמות הללו וכיצד ניתן להשתמש בנתוני הדמיה מתקדמים אלה לצורך כימות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture inserts</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3932.300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>SOLVECO</td>
			<td>6095714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>&#160;SARSTEDT</td>
			<td>2045221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cluster of differentiation 31 (CD31)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab23747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia X1000 Coverslip</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>10318963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>AESCULAP</td>
			<td>FB395R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse 647&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit 568</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human type II cells</td>
			<td>Terrace Biotech</td>
			<td>TB-27AHT2-280&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Fluoromount-G Mounting Medium</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>E41473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1003467046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopersicon Esculentum lectin</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>2531965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>50-100-8798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cup</td>
			<td>kontorsgiganten</td>
			<td>885221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>STILLE</td>
			<td>101-8380-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth muscle actin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K54329188239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>LOCTITE</td>
			<td>2721643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated vibratome sectioning of agarose-embedded lung tissue for multiplex fluorescence imaging

בשל השבריריות המבנית הטבועה בה, הריאה נחשבת לאחת הרקמות הקשות יותר לעיבוד עבור קריאות מיקרוסקופיות. כדי להוסיף תמיכה מבנית לחתך, חתיכות של רקמת ריאה מוטמעות בדרך כלל בתרכובת פרפין או OCT ונחתכות עם מיקרוטום או קריוסטט, בהתאמה. טכניקה עדכנית יותר, המכונה פרוסות ריאה חתוכות במדויק, מוסיפה תמיכה מבנית לרקמת ריאה טרייה באמצעות חדירת אגרוז ומספקת פלטפורמה לשמירה על רקמת הריאה הראשונית בתרבית. עם זאת, בשל מיסוך אפיטופים ועיוות רקמות, אף אחת מהטכניקות הללו אינה מתאימה לפיתוח קריאות הדמיית אור מתקדמות הניתנות לשחזור, שיהיו תואמות בין נוגדנים ומינים מרובים. 
לשם כך, פיתחנו צנרת לעיבוד רקמות, המשתמשת בהטבעה אגרוזית של רקמת ריאה קבועה, יחד עם חתך ויברטומי אוטומטי. זה הקל על יצירת קטעי ריאה בעובי של 200 מיקרומטר עד 70 מיקרומטר, בריאות עכבר, חזיר ואדם, שאינם דורשים שליפת אנטיגן, ומייצגים את הגרסה הכי פחות "מעובדת" של הרקמה המבודדת המקומית. באמצעות פרוסות אלה, אנו חושפים קריאת הדמיה מרובת משתתפים המסוגלת להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה שניתן להשתמש בביטוי החלבונים המרחבי שלהן כדי לכמת ולהבין טוב יותר את המנגנונים העומדים בבסיס פגיעה והתחדשות ריאתית.

Ex vivo lung tissue slices are extensively used in the study of lung disease1. Current gold standards, particularly in clinical and translational large animal studies, employ hematoxylin and eosin staining coupled with brightfield microscopy and observer-based scoring to assess and grade lung dysfunction2,3. While still a valuable technique, it exhibits limitations in terms of spatial resolution and the number of markers that can be imaged simultaneously. Moreover, lung tissue is required to undergo extensive solvent-based washes, which results in dehydration, shrinkage, and rehydration of the tissue before its final imaging4. This process is not only time-consuming but is also environmentally unfriendly, masks protein epitopes, and may invoke structural tissue changes5,6,7,8. However, for lung tissue, embedding in paraffin prior to sectioning has been a necessity owing to the structural fragility of the lung. In contrast, solid organs such as the brain can be cut using a vibrating microtome (vibratome), both in fixed and fresh tissue9,10,11,12.
To enable vibratome sectioning in lung tissue, a method termed precision-cut lung slices&#160;(PCLS) was established where low melting point agarose is injected into fresh lung tissue via the airways or blood vessels and left to solidify13,14. The agarose in the airways provides sufficient structural support to then allow vibratome sectioning9,14. In rodents, this is simple to achieve as agarose can be injected via the trachea; however, in pig and human tissue, it can be challenging to locate a suitable airway/vessel within a given biopsy15,16. Moreover, even if such an airway/vessel is located, substantial force is usually required to inject the agarose, which may influence subsequent lung morphology17.
To overcome the challenges experienced in paraffin embedding/sectioning/staining and the PCLS workflow, we have established a new processing pipeline for fixed lung tissue. This workflow allows the use of a vibratome for sectioning, can produce thinner slices than in PCLS, and yields slices that do not require antigen retrieval for multiplex fluorescence imaging. This method offers a means of &#34;least processing&#34; to generate lung sections that can be used in advanced light microscopy. Moreover, imaging readouts can be used to demonstrate the spatial relationships of cells and anatomical structures within the lung tissue by capturing the volumetric architecture of the tissue18,19,20,21. This paper describes the protocol to generate these lung sections and demonstrates multiplex stains applied to each of these tissues and how these advanced imaging data can be used for quantification.

Author Spotlight: חקר ביטוי חלבונים מרחביים באמצעות מקטעי רקמת ריאה משובצים באגרוז 

חתך ויברטומי אוטומטי של רקמת ריאה משובצת אגרוז להדמיית פלואורסצנטיות מרובת משתתפים

This protocol is particularly useful in large animal models of lung transplantation and regeneration, such as pigs, where we can sample small pieces over time. This technique can help us better understand the spatial biology at play in these models. This technique produces minimally-processed lung slices suitable for immunofluorescence imaging without the need for antigen retrieval, and has been effective with all antibodies tested to date.This procedure can be adapted to cut slightly thicker sections, say around one millimeter, which can be then used in light sheet fluorescence microscopy to study the spatial protein expression in a more three-dimensional volume. Our research is investigating factors influencing lung transplant rejection, and developing therapies to reduce rejection using our pig model. This technique helps understand spatial protein changes affecting transplant outcomes post-surgery.We're currently using this technique to explore the spatial protein expression landscape in our pig lung transplant model. We hope that it will help us to better understand the mechanisms behind our experimental therapies. The key to succeeding here lies in vibratome sightings, high blade amplitudes, and lower force speeds are key things to look at if the sectioning goes badly.

תהליך יצירת פרוסות רקמת הריאה כולל מספר שלבים מרכזיים, כולל הכנה, הטבעה וחתך. תמיסת האגרוז (3% (w/v) מיוצרת על ידי המסת 1.5 גרם של אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה ב-50 מ"ל של PBS סטרילי. החומרים המתכלים הדרושים כוללים פלסטיק, מכסה מצינור חרוטי של 50 מ"ל (השפה הוסרה), מלקחיים ומספריים. רקמת הריאה עוברת כריתה זהירה לגושים קטנים יותר בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים סטריליים (איור 1A,B). לאחר מכן, כדי להטמיע את גושי רקמת הריאה, תחתית הכוס מלאה בכמות קטנה של האגרוז, מכסה מונח על פני השטח של האגרוז, והכוס מאוחסנת בטמפרטורה של 4°C למשך 5 דקות (איור 1C). כ 1 מ"ל של agarose נוזלי מתווסף למכסה, ואת בלוק רקמת הריאה ממוקם על המכסה. האגרוז נשאר למשך 2-3 דקות כדי להתמצק למחצה בטמפרטורת החדר (איור 1D). ברגע שגוש ריאה מוחזק במקומו על ידי האגרוז המוצק למחצה, האגרוז הנוזלי מוזג לכוס עד שגוש רקמת הריאה שקוע במלואו. זה מאוחסן ב-4°C למשך 15 דקות (איור 1E,F). הטמעת האגרוז בעלת נקודת ההתכה הנמוכה מספקת את התמיכה והנוקשות הדרושות לרקמת הריאה, מה שעוזר לשמור על הארכיטקטורה המקורית שלה במהלך תהליך החיתוך. להב חד משמש להסרת אגרוז עודף סביב רקמת הריאה. סביב הרקמה נותרת שכבה אחידה בעובי של כ-5 מ"מ (איור 1G). לאחר מכן בלוק רקמת הריאה שנכרת מודבק בזהירות על מחזיק הרקמה (איור 1H). מגש חיץ הוויברטומים מלא ב-PBS, קרח ממוקם באמבט הקרח שמסביב, ודיסק הדגימה מותקן במגש החיץ (איור 1I). פרמטרי חיתוך הוויברטומה שנקבעו בלוח היו: עובי פרוסה: 200 מיקרומטר; תדר: 100 הרץ; משרעת הלהב: 1.3 מ"מ; מהירות קדימה של הלהב: 0.02-0.03 מ"מ לשנייה, אשר תלויה בנוקשות הרקמה (איור 1J). לבסוף, הצביעה מתבצעת על פרוסות צפות בחופשיות (איור 1K-M). 
צביעה אימונופלואורסצנטית בוצעה בחתכים של 200 מיקרומטר מכל מין עבור אקטין שריר חלק (SMA, תא שריר חלק וסמן מיופיברובלסט), אלסטין (חלבון מטריצה חוץ-תאי) וליקופסיקון אסקולנטום לקטין (LEA), הנקשר לתאי אפיתל ברונכואלבאולריים. הריאה היא רקמה הטרוגנית מבחינה מבנית, ולכן נצפתה התפלגות דיפרנציאלית של SMA ואלסטין בין מבנים, כולל צינורות מכתשית, כלי דם, סימפונות תוך-ריאתיים ונאדיות מעכברים, חזירים ובני אדם (איור 2A-L). עיבוד ברזולוציה גבוהה של נפח 20 מיקרומטר של סימפונות מראה כיצד ניתן לבחון מבנים עדינים בתוך הריאה ברמה תלת ממדית למחצה (וידאו משלים S1). כדוגמה כמותית, תוך שימוש במעקב אחר תמונות, אנו מראים כיצד גודל הנאדיות שונה בין דגימות (n = 20 נאדיות) (איור 2L,M).
כדי להראות כיצד ניתן לנצל כמותית את נתוני ההדמיה המתקדמים הללו, השווינו התפלגות תאי פנאומוציט מסוג 2 (TII) ברקמת ריאה אנושית ממבוגר ותינוק. לנוגדן תאי מכתשית מסוג 2 הספציפי לאדם, HTII-280, יש זיקה חזקה לפני השטח של תאים אנושיים מסוג 2 (איור 3A-F). תאים אלה ניתן גם לראות בחלל התלת-ממדי של נאדית בודדת באמצעות הדמיה נפחית (וידאו משלים S2). כדי לכמת את מספר TII בין דגימות המבוגרים והתינוקות, עיבדנו את ספירת HTII-280 על פני 10 שדות ראייה אקראיים (fov). בין הדגימות האלה, דגימת התינוקות הניבה ספירת תאי TII גבוהה משמעותית (איור 3G). אולם דגימת התינוקות גם הראתה כיסוי פיגומים גבוה משמעותית מאשר המבוגר, מה שיכול להסביר את מספר התאים הגבוה יותר (איור 3H). כדי להסביר זאת, לאחר מכן הערכנו את מספר TIIs בהתבסס על כיסוי פיגומים, כתאים למ"מ 2 של רקמה, שעדיין שמרו על מספר גבוה משמעותית של TII בדגימת התינוקות (איור 3I). לפיכך, ספירת TII גבוהה יותר בדגימת התינוקות אינה נובעת מכיסוי פיגומים מוגבר ומדגישה את החשיבות של הערכת התפלגות התאים בריאה בהתבסס על שטח הפיגום ולא על בסיס ה- FOV הכולל.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65943/65943fig01.jpg"> איור 1: פרוטוקול לחיתוך פרוסות רקמת ריאה. (A) התמיסות והחומרים: תמיסת אגרוז של 3% (w/v) המתקבלת על ידי המסת 1.5 גרם של אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה ב-50 מ"ל של מלח סטרילי חוצץ פוספט; פלסטיק; מכסה מ 50 מ"ל צינור חרוט; מלקחיים, ומספריים. (B) רקמות הריאה נותחו באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים סטריליים. (ג) ממלאים את תחתית הכוס בכמות קטנה של אגרוז ומניחים את המכסה על פני האגרוז; לאחר מכן, אחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C למשך 5 דקות. (D) הוסיפו 1-2 מ"ל של אגרוז נוזלי למכסה באיטיות, הניחו את גוש רקמת הריאה על המכסה בזהירות, ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C למשך 2 דקות. (E,F) מזגו את האגרוז הנוזלי לכוס עד שגוש רקמת הריאה שקוע במלואו, אחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות, ואז לשבור את הפלסטיק בעדינות. (G) השתמשו בלהב חד כדי להסיר עודפי אגרוז סביב רקמת הריאה, והשאירו שכבה אחידה בעובי של כ-5 מ"מ סביב הרקמה. (H) בלוק רקמת הריאה שנכרת מודבק בזהירות על מחזיק הרקמה. (I) מלא את מגש מאגר הוויברטומים ב-PBS, מקם קרח באמבט הקרח שמסביב והתקן את דיסק הדגימה במגש החיץ. (J) להגדיר פרמטרי חיתוך בלוח הוויברטום; עובי פרוסה: 200 מיקרומטר, תדירות: 100 הרץ, משרעת הסכין: 1.3 מ"מ, ומהירות קדימה של הלהב 0.02-0.04 מ"מ לשנייה. (K-M) תמונות מייצגות של פרוסה צפה בחופשיות עדיין משובצת באגרוז ומוכנה לצביעת אימונופלואורסצנטיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65943/65943fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65943/65943fig02.jpg"> איור 2: תמונות אימונופלואורסצנטיות של מבנה הריאה בבני אדם, חזירים ועכברים. (A-L) תמונות מייצגות של צינור מכתשית, כלי דם, סימפונות ונאדיות בפרוסות רקמת ריאה של עכבר, חזיר ואדם, בהתאמה. SMA (מוצג בירוק) הוא סמן לתאי שריר חלקים ונצפה בדפנות כלי הדם והסימפונות של רקמת הריאה. אלסטין (מוצג באדום) מהווה חלק מהמטריצה החוץ תאית של הריאות. (M) כימות גודל הנאדיות על ידי בחירת 20 מיקומים אקראיים על כל פרוסת רקמת ריאה עבור דגימות אדם, חזיר ועכבר. היסטוגרמות שימשו כדי להמחיש את התפלגות גודל הנאדיות בתוך כל קבוצה. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר (A-F, H-L), 100 מיקרומטר (G). מבחן Kruskall-Wallis. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. קיצורים: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; SMA = אקטין שריר חלק; ms = עכבר; HMN = אדם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65943/65943fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65943/65943fig03.jpg"> איור 3. התפלגות פנאומוציט מסוג 2 בדגימות אדם, מבוגרים ותינוקות. (א,ב) תמונות מייצגות של רקמת ריאה אנושית של מבוגרים ותינוקות מוכתמת עבור HTII-280 (מוצג באדום), CD31 (מוצג בירוק) ו-LEA (מוצג באפור). (ג,ד) תמונות מייצגות של בני אדם בוגרים ותינוקות המציגות התפלגות פנאומוציט מסוג 2 בלבד. (ה,ו) רזולוציה של תא בודד מייצגת תמונות של פנאומוציט מסוג 2 בודד מדגימות ריאה אנושיות של מבוגרים ותינוקות. (G) כימות מספר הפנאומוציטים מסוג 2 בין דגימות מבוגרים לתינוקות. (H) כימות כיסוי שטח פיגום רקמת הריאה (% לעומת אוויר) בדגימות מבוגרים ותינוקות. (I) כימות של פנאומוציט מסוג 2 למ"מ 2 של רקמה בדגימות מבוגרים ותינוקות. פסי קנה מידה = 5 מיקרומטר (E,F), 100 מיקרומטר (A-D). n = 10 fov לדגימה. מבחן t לא מזווג או מבחן מאן-ויטני. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. קיצורים: DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; HTII = תאים מסוג II אנושיים; CD31 = מולקולת הידבקות תאי אנדותל טסיות דם-1/אשכול התמיינות 31; FOV = שדה ראייה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65943/65943fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
וידאו משלים S1: וידאו של נפח הדמיה של 20 מיקרומטר של נתיב אוויר חזירי יחיד מוכתם באמצעות DAPI, LEA, SMA ואלסטין המציג תצוגה ברזולוציה גבוהה של המבנה של אלמנטים בדופן נתיב האוויר. קיצורים: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; SMA = אקטין שריר חלק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65943/Sup_vid1.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
וידאו משלים S2: וידאו של נפח הדמיה של 30 מיקרומטר של נאדית בודדת מוכתמת באמצעות DAPI, LEA ו-HTII-280 המראה פיזור פנאומוציט מסוג 2 על פני המבנה. קיצורים: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; SMA = אקטין שריר חלק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65943/Sup_vid2.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Spatial Protein Expression Using Agarose Embedded Lung Tissue Sections at JoVE.com

פיתחנו טכניקת עיבוד רקמות המשתמשת ברקמת ריאה משובצת ויברטומה ואגרוז ליצירת קטעי ריאה, ובכך אפשרנו רכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורת ריאות. השתמשנו בצביעת אימונופלואורסנציה כדי לצפות בביטוי חלבונים מרחבי באמצעות סמנים מבניים ספציפיים של הריאה.

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural ...

פרוטוקול זה שימושי במיוחד במודלים של בעלי חיים גדולים של השתלת ריאות והתחדשותם, כגון חזירים, שבהם אנו יכולים לדגום חתיכות קטנות לאורך זמן. טכניקה זו יכולה לעזור לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה המרחבית הפועלת במודלים האלה. טכניקה זו מייצרת פרוסות ריאה בעיבוד מינימלי המתאימות להדמיית אימונופלואורסנציה ללא צורך בשליפת אנטיגן, והייתה יעילה בכל הנוגדנים שנבדקו עד כה.הליך זה יכול להיות מותאם לחתוך חלקים עבים מעט יותר, נניח סביב מילימטר אחד, אשר ניתן להשתמש בהם במיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור כדי לחקור את ביטוי החלבון המרחבי בנפח תלת ממדי יותר. המחקר שלנו חוקר גורמים המשפיעים על דחיית השתלת ריאות, ומפתח טיפולים להפחתת דחייה באמצעות מודל החזיר שלנו. טכניקה זו מסייעת להבין שינויים חלבוניים מרחביים המשפיעים על תוצאות ההשתלה לאחר הניתוח.אנו משתמשים כעת בטכניקה זו כדי לחקור את נוף ביטוי החלבונים המרחבי במודל השתלת ריאות החזיר שלנו. אנו מקווים שזה יעזור לנו להבין טוב יותר את המנגנונים שמאחורי הטיפולים הניסיוניים שלנו. המפתח להצלחה כאן טמון בתצפיות ויברטום, אמפליטודות להב גבוהות ומהירויות כוח נמוכות יותר הם דברים מרכזיים שיש להסתכל עליהם אם החתך משתבש.

automated-vibratome-sectioning-agarose-embedded-lung-tissue-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging

2.7K Views.  Lund University. פרוטוקול זה שימושי במיוחד במודלים של בעלי חיים גדולים של השתלת ריאות והתחדשותם, כגון חזירים, שבהם אנו יכולים לדגום חתיכות קטנות לאורך זמן. טכניקה זו יכולה לעזור לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה המרחבית הפועלת במודלים האלה. טכניקה זו מייצרת פרוסות ריאה בעיבוד מינימלי המתאימ?...

Video: Author Spotlight: חקר ביטוי חלבונים מרחביים באמצעות מקטעי רקמת ריאה משובצים באגרוז 

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural support for sectioning, pieces of lung tissue are commonly embedded in paraffin or OCT compound and cut with a microtome or cryostat, respectively. A more recent technique, known as precision-cut lung slices, adds structural support to fresh lung tissue through agarose infiltration and provides a platform to maintain primary lung tissue in culture. However, due to epitope masking and tissue distortion, none of these techniques adequately lend themselves to the development of reproducible advanced light imaging readouts that would be compatible across multiple antibodies and species. 
To this end, we have developed a tissue-processing pipeline, which utilizes agarose embedding of fixed lung tissue, coupled to automated vibratome sectioning. This facilitated the generation of lung sections from 200 &#181;m to 70 &#181;m thick, in mouse, pig, and human lungs, which require no antigen retrieval, and represent the least "processed" version of the native isolated tissue. Using these slices, we reveal a multiplex imaging readout capable of generating high-resolution images whose spatial protein expression can be used to quantify and better understand the mechanisms underlying lung injury and regeneration.

We have developed a tissue-processing technique utilizing a vibratome and agarose-embedded lung tissue to generate lung sections, thereby permitting the acquisition of high-resolution images of lung architecture. We employed immunofluorescence staining to observe spatial protein expression using specific lung structural markers.

Agarose Embedding of Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging

To begin, fix the porcine lung tissue in 4%paraformaldehyde at room temperature for 48 hours. Then transfer the lung tissue to a 50 milliliter conical tube containing 30 milliliters of PBS with 0.01%Sodium Azide. Keep a plastic cup fine forceps and sterile scissors ready.Heat the agarose in a microwave until it reaches boiling point. Then cool it down to 42 degrees Celsius in a water bath. Store it in the water bath until ready for use.Remove the lung biopsy from the PBS Azide solution. Use fine forceps and sterile scissors to carefully dissect the lung lobes into smaller blocks. Next, cut down the middle of a plastic cup.Pour a small amount of agarose at the bottom of the cup. Place the lid of a 50 milliliter conical tube with its rim removed on the agaro surface. Store this set up at four degrees Celsius for five minutes to allow the agarose to solidify.Once the agarose has solidified, remove the plastic cup from the refrigerator. Now pour about one milliliter of liquid agarose onto the lid. Then gently place the lung tissue block on the lid.Once the agarose has semis solidified, slowly submerged the lung tissue in liquid agarose. Refrigerate the setup at four degrees Celsius for about 15 minutes until the agarose becomes solid. Use a sharp blade to carefully remove any excess agarose surrounding the lung tissue.

שיבוץ אגרוז של רקמת ריאה להדמיית פלואורסצנטיות מולטיפלקס

Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue

To begin, embed the lung tissue in agarose. To prepare the lung tissue for sectioning, first, attach each tissue block to the specimen disc of the vibratome with super glue and add ice to the surrounding bath. Then carefully install the specimen disc into the buffer tray and fill the tray with PBS.Next, set the vibratome parameters, keeping the thickness at 200 micrometers, the frequency at 100 hertz, the amplitude of the blade at 1.3 millimeters, and the forward speed of the blade between 0.02 and 0.03 millimeters per second. Commence the sectioning of the lung tissue. Once enough slices have been created, use a brush to gently lift the tissue slice from the vibratome tray.Transfer the slices to a 24 well plate with PBS azide solution. Preserve the lung slices at four degrees Celsius.

חתך ויברטומי של רקמת ריאה משובצת אגרוז

Immunostaining of Agarose-Embedded Lung Tissue Sections

Begin by embedding lung tissue and agarose and sectioning it using a vibratome. To the sliced tissues, add 300 microliters of the blocking agent. Incubate the plate at four degrees Celsius on a shaker with gentle agitation for 45 minutes.Next, pipette 300 microliters of the PBS diluted primary antibody into each well. Incubate the plate overnight at four degrees Celsius with gentle shaking. Now gently pipette out the primary antibodies without touching the slice.Wash the slices three times with 400 microliters of PBS. Next, pipette 300 microliters of the dilute secondary antibodies into each well. Remove the antibody solution after cold incubation for 90 minutes.Then add the DAPI and tomato lectin 488 to the wells. Incubate the mixture for 30 minutes. After removing DAPI and tomato lectin, wash the slices in PBS for three cycles of 10 minutes.With a brush, transfer the slices to a slide. Place three drops of mounting medium on the slide and mount a cover slip over it before imaging. The lung sections of mouse, pig, and human samples were immunofluorescently stained for SMA, elastin, and LEA.The SMA and elastin were observed to be distributed across structures such as alveolar ducts, blood vessels, bronchioles, and alveoli. Comparison of type II pneumocytes distribution in adult and infant humans was performed. The type II alveolar cell antibody HT2-280 had a strong affinity to the pneumocytes cell surface.The infant sample yielded a significantly higher type II pneumocytes count. However, the infant sample also exhibited a significantly higher scaffold coverage than the adult. The number of type II pneumocytes based on scaffold coverage was also significantly higher in the infants.