Zu Beginn wurden hiPS-Zellen in IPSC-Erhaltungsmedium auf einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte kultiviert, die mit wachstumsfaktorreduziertem extrazellulärem Matrixgel beschichtet war. Wenn die Zellen 80 bis 90 % V erreicht haben, entfernen Sie das Medium von der Platte und waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS. Dann 700 bis 800 Mikroliter 0,48 Millimolar EDTA zugeben und eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren.
Nehmen Sie die Aufschlusslösung heraus und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten. Wenn die Zellen in Blätter aufgeschlossen werden, fügen Sie zwei Milliliter IPSC-Erhaltungsmedium hinzu, um die Verdauung zu beenden. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine Platte mit sechs Wells mit niedrigem Aufsatz.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 60 U/min, um kugelförmige Embryokörper oder EBs zu bilden. Nach 24 Stunden werden die EBs mit einer früheren Pipette in das Zentrifugenröhrchen überführt und fünf bis 10 Minuten lang sedimentiert, bevor der Überstand entfernt wird. Geben Sie MSC-Differenzierungsmedium in das Röhrchen und übertragen Sie die EBs auf eine Sechs-Well-Klinge mit niedrigem Aufsatz mit zwei Millilitern MSC-Differenzierungsmedium.
Kultivieren Sie die EBs auf dem Shaker bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid sieben Tage lang. Am achten Tag werden die EBs in das Zentrifugenröhrchen überführt, wie zuvor gezeigt. Sobald die EBs sedimentiert sind, entfernen Sie den Überstand aus dem Rohr.
Geben Sie MSC-Erhaltungsmedium in das Röhrchen und überführen Sie die EBs auf eine wachstumsfaktorreduzierte extrazelluläre Matrixgel-beschichtete Sechs-Well-Platte mit zwei Millilitern MSC-Erhaltungsmedium. Wechseln Sie nach der Zelladhäsion das Medium, bis die Kultur eine Konfluenz von 90 % erreicht hat. Als nächstes wird die EB-abgeleitete Kultur mit einer Dissoziationslösung bei 37 Grad Celsius behandelt.
Wenn ein Teil der Zellen in einzelne Zellen aufgeschlossen ist, fügen Sie zwei Milliliter des MSC-Erhaltungsmediums hinzu, um den Aufschluss zu beenden, und überführen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die verbleibenden unverdauten Zellen einmal mit DPBS aus den Vertiefungen. Und verdauen Sie erneut, wie zuvor gezeigt.
Zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension bei 250 g für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und säen Sie die Zellen in eine mit Gelatine beschichtete Kulturplatte. Kultivieren Sie die Zellen im MSC-Erhaltungsmedium bis zu 90 % Konfluenz mit regelmäßigem Mediumwechsel.
Kultur-hiIPC-Linien, wie zuvor gezeigt. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 50 bis 60 % erreicht haben, entfernen Sie das IPSC-Wartungsmedium von der Platte. Fügen Sie zwei Milliliter MSC-Erhaltungsmedium hinzu.
Und Kultur für 14 Tage bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit täglichem Mediumwechsel. Für die Reifung von MSCs wird die Monolayer-Kultur mit einer Dissoziationslösung bei 37 Grad Celsius behandelt. Wenn ein Teil der Zellen in einzelne Zellen aufgeschlossen ist, geben Sie zwei Milliliter des MSC-Erhaltungsmediums in die Vertiefungen, um den Aufschluss zu beenden, und überführen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen.
Waschen Sie die verbleibenden unverdauten Zellen einmal mit DPBS und verdauen Sie sie wie zuvor gezeigt. Zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension wie zuvor gezeigt und säen Sie die Zellen auf einer mit Gelatine beschichteten Kulturschale. Kultivieren Sie die Zellen im MSC-Erhaltungsmedium bis zu 90 % Konfluenz mit regelmäßigem Mediumwechsel.
Bei der EB-Formationsmethode zeigten hiIPC-Kolonien vor der Differenzierung eine kompakte Morphologie. Nach der Dissoziation bildeten sich gleichmäßige sphärische EBs, die mit der Zeit an Volumen zunahmen. Anschließend verwandelten sich EBs in adhärente Monolayer-Zellen, erreichten bis zum 18. Tag eine Konfluenz von 90 % und nahmen nach zwei Durchgängen eine spindelförmige Morphologie an.
In ähnlicher Weise vermehrten sich bei der Monolayer-Methode die Zellen und bildeten mehrschichtige adhärente Zellen. Nach mehrmaligem Verpacken reiften die Zellen zu MSC mit typischer Spindelform und wirbelnder Kolonie. Die Durchflusszytometrie ergab, dass die hiIPCs positiv für CD90 und negativ für CD34, CD45, CD105 und CD73 waren.
Nach der Differenzierung exprimierten die hiIPCs, die MSCs antreiben, CD90, CD73 und CD105, während sie für CD34 und CD45 negativ blieben. Monolayer-abgeleitete MSCs zeigten eine höhere Kalziumablagerungsbildung als die EB-Methode. Es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede in den adipogenen und chondrogenen Differenzierungsfähigkeiten beobachtet.
Die Proliferationsfähigkeit beider Methoden blieb für bis zu 20 Passagen erhalten.
