Zu Beginn tauen Sie die isolierten Blutplasmaproben bei 37 Grad Celsius auf. 100 Mikroliter jeder Plasmaprobe werden in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Geben Sie einen Milliliter kalziumfreien HBSA-Puffer in jedes Röhrchen.
Die Proben werden bei 20.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand auf 20 Mikroliter an, ohne das Pellet zu stören. Als nächstes geben Sie einen Milliliter des kalziumfreien HBSA-Puffers in jedes Röhrchen.
Pipettieren Sie dann nach oben und unten, um das Pellet zu rekonstituieren. Jedes Röhrchen einige Sekunden lang vortexen, um eine gleichmäßige Verteilung der extrazellulären Vesikel zu gewährleisten. Dann bei 20.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Auch hier wird der Überstand auf 20 Mikroliter abgesaugt, ohne das Pellet zu stören. Anschließend wird das Pellet in 80 Mikroliter kalziumfreiem HBSA-Puffer rekonstituiert. Pipettieren Sie die Suspension auf und ab, um eine gleichmäßige Aufhängung zu erhalten.
Um die Aktivität des extrazellulären Vesikelgewebefaktors zu messen, werden zunächst 40 Mikroliter der extrazellulären Vesikelprobe in zwei Vertiefungen einer 96-Well-Platte pipettiert. In die erste Vertiefung werden 11 Mikroliter eines hemmenden Maus-Anti-Human-TF-IgG gegeben. In die andere Vertiefung geben Sie 11 Mikroliter Kontrollmaus-IgG.
Nach der Inkubation werden 50 Mikroliter der Faktor-Mix-Lösung in jede Vertiefung gegeben. Decken Sie die Platte mit Folie ab und inkubieren Sie die Platte dann zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie 25 Mikroliter HBSA-EDTA-Puffer hinzu, um die Bildung des Faktors Xa zu stoppen.
Das chromogene Substrat wird in destilliertem Wasser auf eine Konzentration von vier Millimol rekonstituiert. Geben Sie nun 25 Mikroliter des chromogenen Substrats in jede Vertiefung. Decken Sie die Platte mit Folie ab und wickeln Sie sie anschließend in Alufolie ein.
Die Platte bei 37 Grad Celsius 15 Minuten lang inkubieren. Anschließend zentrifugieren Sie die Platte eine Minute lang bei 1.500 g, um alle Blasen zu entfernen. Legen Sie die Platte dann in einen Plattenleser bei 405 Nanometern.
Verwenden Sie die Standardkurve, die mit dem Faktor für relipidiertes rekombinantes Gewebe generiert wurde, um die Faktor-Xa-Generierung jedes Wells umzurechnen. Berechnen Sie dann die Gewebefaktor-abhängige Faktor-Xa-Erzeugung. Sechs von 11 Spendern waren mittlere bis hohe Lipopolysaccharid-Responder, während fünf von 11 Spendern niedrige Lipopolysaccharid-Responder waren.
