Schalten Sie zunächst die Imaging-Software ein. Öffnen Sie das Fenster "Übernehmen". Stellen Sie die Belichtungszeit auf 500 Millisekunden, den Kamerabereich auf Full-Chip und das Binning auf eins ein und stellen Sie dann die Beleuchtung für den gewünschten Kanal ein.
Verwenden Sie zum zytoplasmatischen Rühren Durchlicht, um den Eizellenkern zu fokussieren. Konzentrieren Sie sich bei nuklearen Speckle-Experimenten auf SRSF2-GFP-Tröpfchen. Um die Aufnahmegeschwindigkeit zu optimieren, stellen Sie auf der Registerkarte Spezial den Kameraverschluss auf Öffnen für die Belichtung und den Clear-Modus ein, um die Vorsequenz zu löschen.
Öffnen Sie als Nächstes das Fenster Stream Acquisition. Stellen Sie auf der Registerkarte "Erfassen" den Aufnahmemodus so ein, dass er in den RAM streamt und die Anzahl der Frames auf 480 ein. Stellen Sie die Kameraparameter so ein, dass Bilder mit der Bildrate aufgenommen werden, und die Anzahl der Bilder, die auf Null springen sollen.
Stellen Sie auf der Registerkarte "Parameter des Digitalkamera-Controllers" den Kamerastatus auf "Anhalten", den Verschlussmodus auf "Nie öffnen", den Löschmodus auf "Vorsequenz" und die Anzahl der Bilder auf "Eins" ein. Passen Sie als Nächstes einen Interessenbereich um das Objekt an. Klicken Sie im Fenster Stream-Aufnahme auf Erfassen, um den Film zu starten.
Speichern Sie den Film nach der Erfassung als TIFF-Datei. Öffnen Sie für die Bildanalyse ImageJ oder Fiji. Klicken Sie in den Plugins auf CIRB und öffnen Sie das Verlhac-Menü, dann wählen Sie Oocyte Nucleus Shape.
Wählen Sie im Dialogfeld den Ordner aus, der die zu analysierenden Filme enthält. Wählen Sie dann den Theta-Winkel und die Ränder zum Zuschneiden aus. Wählen Sie nun die XY-Kalibrierung und das Zeitintervall aus und klicken Sie dann auf OK.To zeichnen Sie die mittlere Form über die Zeit, berechnen Sie in der Tabelle den mittleren Radius R über alle Zeitpunkte T für jeden definierten Theta-Winkel.
Subtrahieren Sie für jedes T und Theta den mittleren Radius R im Laufe der Zeit vom Radius-Kleinbuchstaben r. Berechnen Sie schließlich den Mittelwert der Fluktuationen für alle Zeitpunkte T und alle Winkel Theta für jeden Kern und alle Kerne aus einer Bedingung. In Kontroll-Eizellen zeigte der Zellkern signifikante periphere Fluktuationen, wie sie mit der Kernsonde YFP Rango sichtbar gemacht wurden.
Im Gegensatz dazu blieb der Zellkern in Eizellen mit gestörten Zytoskelettkräften über die Zeit stabil. Die Varianz des Abstands vom Kernschwerpunkt zu seiner Peripherie zeigte eine sechsfache Zunahme der Kontrolleizellen im Vergleich zu solchen mit gestörten Zytoskelettkräften. Kernflecken in Kontroll-Eizellen zeigten im Vergleich zu den gestörten zytoplasmatischen Kräften größere Fluktuationen in den Tröpfchenoberflächen.
