Die Autoren danken allen Mitgliedern des Balboula-Labors für ihre wertvolle Hilfe und Diskussionen. Die Autoren danken Melina Schuh für das freundliche Teilen des mCherry-Cep192-Konstrukts. Diese Studie wurde von R35GM142537 (NIGMS, NIH) an AZB unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden von der University of Missouri genehmigt (Animal Care Quality Assurance Ref. Nummer 9695). Cep192-eGFP Reporter weibliche Mäuse im Alter von 6-8 Wochen wurden in der vorliegenden Studie verwendet. Um Cep192-eGFP-Reportermäuse zu erzeugen, wurde die CRISPR/Cas9-vermittelte homologiegesteuerte Reparatur verwendet, um das EGFP-Reportergen in das CF-1-Mausgenom zu integrieren. Der EGFP-Reporter wurde an der C-Endstation von Cep192 (einem integralen Bestandteil der MTOCs)15 fusioniert. Um die Mauskolonie zu erhalten, wurden homozygote Cep192-eGfp-Reportermäuse verwendet. Alle Tiere wurden in Käfigen (bis zu vier Tiere/Käfig) bei 21 °C und 55% Luftfeuchtigkeit gehalten, mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und Ad-libitum-Zugang zu Futter und Wasser.
1. Entnahme von Mauseizellen
<ol><li>Das Kulturmedium (Chatot, Ziomek und Bavister, CZB19, siehe Materialtabelle) vorbereiten und über Nacht bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren. HINWEIS: Das CZB-Medium kann 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden (siehe Zusatzdatei 1 für die Medienkomposition).</li>
	<li>Ergänzen Sie das CZB-Medium mit Glutamin (1 mM) und Milrinon (2,5 mM) (CZB + M) (siehe Materialtabelle) und legen Sie es in den Inkubator. HINWEIS: Milrinon ist ein Phosphodiesterase-Hemmer, der die in der Prophase I blockierten Eizellen aufrechterhält und die meiotische Wiederaufnahme verhindert20.</li>
	<li>Bereiten Sie das Sammelmedium (bikarbonatfreies minimales essentielles Medium, MEM) vor, das 3 mg/ml Polyvinylpyrolidon (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (Zusatzdossier 1) und Milrinon (2,5 mM) (MEM/PVP + M, siehe Materialtabelle) enthält.</li>
	<li>Bereiten Sie die Sammel- und Kulturschalen vor, stellen Sie vier Mikrotropfen (100 μL) Sammelmedium (MEM/PVP + M) und zwei Mikrotropfen (100 μL) Kulturmedium (CZB + M) in 60 mm bzw. 35 mm Petrischalen her und bedecken Sie sie mit Mineralöl (siehe Materialtabelle). Halten Sie die Auffangschale wärmer auf dem Objektträger und stellen Sie die Kulturschale bei 37 °C und 5% CO2 in den Inkubator.</li>
	<li>Injizieren Sie intraperitoneal 5 IE Serumgonadotropin (PMSG, siehe Materialtabelle) in geschlechtsreife (6-8 Wochen alte) Cep192-eGFP-Reporterinnen 44-48 h vor der Eizellentnahme.</li>
	<li>Opfern Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation, identifizieren und entfernen Sie die Eierstöcke21 und geben Sie sie in ein Uhrenglas mit vorgewärmtem Sammelmedium (MEM/PVP + M) bei 37 °C.</li>
	<li>Fixieren Sie den Eierstock, indem Sie eine 1-ml-Spritze am Boden des Uhrenglases berühren und mehrmals (~ 40 Mal pro Eierstock) mit zusammengebündelten Nähnadeln punktieren, um die Eizellen in das Medium freizusetzen.</li>
	<li>Mit einer Kunststoff-Transferpipette wird das gesamte Medium, das die Cumulus-Eizelle-Komplexe (KOK) enthält, aus Schritt 1.7 in eine leere 100-mm-Kunststoff-Petrischale überführt.</li>
	<li>Sammeln Sie die COCs unter einem Stereomikroskop mit einer Pasteur-Glaspipette und geben Sie sie in die Auffangschale, die MEM/PVP + M enthält.</li>
	<li>Mit einer schmalen Pasteur-Glaspipette (ca. 100 μm Durchmesser) werden die Eizellen mechanisch durch sanftes, wiederholtes Pipettieren entgiftet, anschließend in vier Mikrotropfen (100 μL) MEM/PVP + M (die Auffangschale) überführt und gewaschen, bevor sie in die Kulturschale CZB + M überführt werden.</li>
	<li>Die entblößten Eizellen für 1 h bei 37 °C mit 5% CO2 in der Luft bebrüten.</li>
</ol>2. Mikroinjektion von Eizellen
<ol><li>Geben Sie einen 250 μL Tropfen MEM/PVP + M in einen 100 mm Kunststoff-Petrischalendeckel und decken Sie ihn mit Mineralöl ab. HINWEIS: Der Petrischalendeckel hat einen unteren Rand, der mehr Platz für die Einstellung des Mikromanipulators bietet.</li>
	<li>Schalten Sie das Mikroinjektionssystem ein (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Stellen Sie die Mikroinjektionsschale auf den Wärmetisch (37 °C) des Mikroskops.</li>
	<li>Laden Sie die Injektionsnadel mit 0,5 μL mCh-Cep192cRNA unter Verwendung von Mikroladerpipettenspitzen (siehe Materialtabelle) und befestigen Sie die Injektionsnadel am Mikromanipulator.</li>
	<li>Übertragen Sie die entblößten Eizellen (Schritt 1.11) in den 250 μL Mikrotropfen (Schritt 2.1).</li>
	<li>Stellen Sie unter einem 20- oder 40-fachen Objektiv die Position und den Fokus der Injektions- und Haltenadeln entsprechend der Eizellposition ein (Abbildung 1).</li>
	<li>Richten Sie die Mikroinjektionseinheit ein und stellen Sie den Injektionsdruck (pi), den Kompensationsdruck (pc) und die Injektionszeit (ti) ein, um 5-10 pl mCh-Cep192 cRNA injizieren zu können (um die MTOCs exogen zu markieren).</li>
	<li>Injizieren Sie die Eizellen vorsichtig, ohne den Zellkern zu berühren.</li>
	<li>Sobald alle Eizellen injiziert sind, waschen Sie sie in drei Mikrotropfen CZB + M, geben Sie sie in die Kulturschale (CZB + M) und inkubieren Sie sie für 3 h bei 37 ° C, um die mCh-Cep192-Expression zu ermöglichen.</li>
</ol>3. Eizellreifung
<ol><li>Das Reifungsmedium wird durch Zugabe von Glutamin (1 mM) zu CZB-Medium vorbereitet, das in einem Inkubator mit 5%CO2 in Luft bei 37 °C für mindestens 3 h voräquilibriert wurde.</li>
	<li>Zwei Mikrotropfen (100 μL) des Reifungsmediums in einer 35 mm Petrischale herstellen und mit Mineralöl abdecken (Reifungsschale).</li>
	<li>Waschen Sie Prophase-I-blockierte Eizellen mindestens dreimal in 100 μL Milrinon-freien CZB-Mikrotropfen, um das Milrinon vollständig zu entfernen und eine meiotische Wiederaufnahme zu ermöglichen.</li>
	<li>Die Eizellen werden in die Reifungsschale überführt und für 5 h (Prometaphase-I-Stadium) in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2 in Luft bei 37 °C inkubiert.</li>
</ol>4. Eizellpräparat für Ablation und Bildgebung
<ol><li>Die Prometaphase-I-Eizellen (Schritt 3.4) werden in eine Glasboden-Kulturschale mit 100 μL Reifungsmedium (Schritt 3.1) überführt, die mit Mineralöl bedeckt ist.</li>
</ol>5. Mikroskopische Vorbereitung für die Ablation
<ol><li>Schalten Sie mindestens 30 min vor dem Abtragen den Temperaturregler für den Stufeninkubator ein (siehe Materialtabelle) und stellen Sie ihn auf 37 °C ein.</li>
	<li>Schalten Sie den CO 2 -Regler ein und stellen Sie ihn auf 5% CO2 ein.</li>
	<li>Wählen Sie ein apochromatisches 40-faches Ölimmersionsobjektiv und tragen Sie einen kleinen Tropfen des Immersionsöls auf.</li>
	<li>Montieren Sie die Glasboden-Kulturschale mit den Eizellen auf einen Inkubator und decken Sie den Inkubator mit einem Gasdeckel ab.</li>
	<li>Wählen Sie in der Bilderfassungssoftware (siehe Materialtabelle) eine Option aus, mit der Sie mehrere Stufenpositionen speichern können (z. B. "Markierung definieren und Experiment finden"). Zentrieren Sie mit Durchlicht-Hellfeldbeleuchtung die einzelnen Eizellen und speichern Sie deren Positionen.</li>
	<li>Wählen Sie in der Bilderfassungssoftware den XYZ-Scanmodus , stellen Sie das Bildformat auf 256 x 256 Pixel ein, stellen Sie den Zoomfaktor auf 2,5x - 3,0x ein und wählen Sie eine Scanfrequenz von 600 Hz. Dies entspricht einer Pixelverweilzeit von ca. 1,6 μs.</li>
	<li>Stellen Sie eine 488-nm-Anregungslaserlinie auf etwa 10% der Laserleistung ein (was 4,0 μW auf Probenebene entspricht) (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie eine spektrale Bandbreite von 500-550 nm, um das GFP-Signal der MTOCs zu beobachten. Für die gleichzeitige Beobachtung der Fluoreszenz aus dem mCherry-markierten Cep192 stellen Sie eine 585-nm-Anregungslaserlinie auf etwa 8% der Laserleistung ein (was 10,7 μW auf Probenebene entspricht) und verwenden Sie einen anderen Detektor, der auf eine spektrale Bandbreite von 595-645 nm eingestellt ist. HINWEIS: Es ist hilfreich, den Durchlichtdetektor (TLD) des konfokalen Mikroskops zu verwenden, um Eizellgrenzen gleichzeitig zu erkennen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Live-Scan-Modus und die manuelle Steuerung des Z-Laufwerks, um die Eizelle auf MTOCs zu untersuchen.</li>
	<li>Sobald ein mcMTOC erkannt wurde, zeichnen Sie eine quadratische Region of Interest (ROI) um ihn herum.</li>
</ol>6. Ablation von mcMTOCs
<ol><li>Stellen Sie einen Femtosekundenlaser auf eine Wellenlänge von 740 nm ein. HINWEIS: Die Laserwellenlänge kann je nach Mikroskop und Laserbedingungen geändert werden.</li>
	<li>Verwenden Sie den elektrooptischen Modulator des Multiphotonenmikroskops (siehe Materialtabelle), um die Laserleistung auf 70%-80% einzustellen, was 60-70 mW Leistung auf der Probenebene entspricht. HINWEIS: Wenn der Laser mit einem Femtosekunden-Pulskompensator ausgestattet ist, verwenden Sie diesen, um die Gruppenverzögerungsdispersion (GDD) zu korrigieren. Die GDD-Korrektur reduziert die Menge an Laserleistung, die für eine effiziente mcMTOC-Ablation erforderlich ist, und minimiert Lichtschäden an der Eizelle. Die GDD-Steuerung ist in der Regel in die Bildaufnahmesoftware kommerzieller Multiphotonenmikroskope integriert.</li>
	<li>Verwenden Sie dasselbe Bildformat, denselben Zoomfaktor und dieselbe Scanfrequenz wie in Schritt 5.6. Legen Sie die Parameter für die Mittelung von Linie und Rahmen auf 1 fest.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Scan in der Software, um die Ablation des mcMTOC durchzuführen, indem Sie einen einzigen Laserscan des ausgewählten ROI durchführen.</li>
	<li>Verwenden Sie die Kanaleinstellungen aus Schritt 5.7, um die Ergebnisse der Ablation zu überprüfen, indem Sie die Bilder der GFP-markierten Strukturen vergleichen, die vor und nach der Multiphotonen-Laserbelichtung aufgenommen wurden. Wenn die Ablation erfolgreich ist, sinkt die Intensität der GFP-Fluoreszenz im angestrebten mcMTOC auf die im Hintergrund beobachteten Werte.</li>
	<li>Wenn einige Fragmente einer GFP-Markierungsstruktur verbleiben, wiederholen Sie Schritt 6.4 ein- oder mehrmals, indem Sie sich auf verschiedene z-Ebenen des mcMTOC konzentrieren.</li>
	<li>Verwenden Sie die Kanaleinstellungen aus Schritt 5.7, um die Ablationseffizienz durch den vollständigen Verlust von mcMTOC-assoziierten mCherry-Signalen zu überprüfen (mCh-Cep192).</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 5.8 bis Schritt 6.7, bis alle MTOCs einer Eizelle (auf verschiedenen Fokusebenen) abgetragen sind. HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die mCh-Cep192-Mikroinjektion als Strategie, um die mcMTOC-Depletion nach Multiphotonen-Laserbelichtung zu bestätigen und die Möglichkeit auszuschließen, dass der Verlust der GFP-Fluoreszenz durch GFP-Photobleiche verursacht wird. Die Mikroinjektion dieser Sonde ist jedoch optional und für den Ablationsvorgang nicht erforderlich.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Es gibt verschiedene Methoden, um die zytoskelettbezogenen Strukturen in den Zellen22,23,24,25 zu stören. Es ist jedoch eine Herausforderung, effiziente Techniken zu finden, um die Zielstruktur selektiv zu stören, ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Die hier vorgestellte Multiphotonen-Laserablationsmethode ist eine effiziente Strategie, um eine selektive mechanische Störung von mcMTOCs innerhalb der Eizelle zu induzieren, ohne die Lebensfähigkeit der Eizellen zu verändern.
Die Laserablation wurde umfassend eingesetzt, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die die Chromosomentrennung während der Mitose und Meiose steuern22,23,26,27. Aufgrund der relativ großen Größe (>80 mm Durchmesser) von Säugetiereizellen im Vergleich zu Körperzellen28 stellt die Ablation ihrer intrazellulären Strukturen eine Herausforderung dar. Darüber hinaus beträgt das durchschnittliche mcMTOC-Volumen in Metaphase-I-Eizellen ~20 μm15, was eine zusätzliche Herausforderung darstellt. Um diese Herausforderungen zu meistern, muss eine effiziente Methode eingesetzt werden, die eine tiefere Gewebepenetration ermöglicht. Der Hauptvorteil der Verwendung des Multiphotonenlasers für die Ablation ist seine Fähigkeit, tiefer in die Zelle einzudringen und gleichzeitig Off-Target-Effekte zu minimieren29.
Um die Wirksamkeit und Effizienz der Laserablationsmethode zum Abbau der Zielstruktur zu überprüfen, wird empfohlen, ein fluoreszenzmarkiertes Protein zu verwenden, um die Zielstruktur im Laufe der Zeit (vor und nach der Ablation) zu identifizieren23. Es ist wichtig zu beachten, dass die Laserablation das gesamte mcMTOC als Struktur erschöpft, und obwohl kleinere mcMTOCs nur eine einzige Laserbelichtung benötigen, um erschöpft zu sein, können größere mcMTOCs mehr als eine Laserbelichtung auf verschiedenen Fokusebenen erfordern. Es wird auch empfohlen, eine Untergruppe von Kontroll- und mcMTOC-ablatierten Eizellen mit einem MTOC-Marker (wie γ-Tubulin, Pericentrin oder Cep192) zu fixieren und zu immunisieren, um die Effizienz der mcMTOC-Ablation weiter zu bestätigen. In Kontrolloozyten werden Bereiche des Zytoplasmas, die direkt an mcMTOCs angrenzen, sich aber nicht mit mcMTOCs überlappen, dem Laser ausgesetzt.
Dieses Experiment erfordert mehrere mcMTOC-Ablationen während der Bewegung zwischen verschiedenen Fokusebenen innerhalb der Eizellen. Daher wird dringend empfohlen, diese Technik vor der Durchführung des Experiments mehrmals zu üben, um die Experimentzeit zu minimieren und dadurch die Lebensfähigkeit der Eizellen zu erhöhen. Darüber hinaus ist es wichtig, die minimale Laserleistung zu verwenden, die ausreicht, um die mcMTOCs zu erschöpfen, ohne die Lebensfähigkeit der Eizellen zu beeinträchtigen.
Diese Technik hat einige Einschränkungen. Erstens sind konfokale Multiphotonenmikroskope relativ teurer als normale konfokale Mikroskope. Zweitens ist die Störung aller mcMTOCs auf verschiedenen Fokusebenen zeitaufwendiger als chemische oder genetische Störungen. Drittens erfordert dieses Protokoll technische Fähigkeiten, um alle mcMTOCs in kürzester Zeit abzutragen. Einmal beherrscht, bietet die Verwendung des Multiphotonenlasers jedoch eine hervorragende Strategie, um mehrere intrazelluläre Strukturen in Mauseizellen, einschließlich mcMTOCs, zu stören, was zum Verständnis der molekularen Mechanismen beiträgt, die die Positionierung der Spindel und ihre rechtzeitige Migration in Säugetiereizellen regulieren.

Haploide Gameten (Spermien und Eizellen) werden durch Meiose produziert, die eine Runde DNA-Replikation beinhaltet, gefolgt von zwei aufeinanderfolgenden Teilungen, die für die Verringerung der Chromosomenzahl vor der Befruchtung notwendig sind. Bei Säugetieren erfährt die Eizelle während des frühen fetalen Lebens einen längeren Arrest (bis zur Pubertät) im Diplotenstadium der Prophase I der ersten meiotischen Teilung, einem Stadium, das als Keimvesikel (GV) bezeichnet wird. Nach der meiotischen Wiederaufnahme erfährt die GV-Eizelle einen Kernhüllenabbau (NEBD), und die Spindel wird hauptsächlich im Eizellzentrum 1,2,3 aufgebaut. Später, angetrieben von F-Aktin, wandert die Spindel rechtzeitig vom Eizellzentrum zum Kortex, um eine stark asymmetrische Teilung zu gewährleisten, was zu einem Ei mit einem winzigen Polkörper (PB)4,5,6 führt.
In mitotischen Zellen bestehen die Zentrosomen aus einem Paar Zentriolen, die von perizentriolären Materialkomponenten (PMC) wie Pericentrin, γ-Tubulin, Cep152 und Cep1927 umgeben sind. Diese zentriolhaltigen Zentrosomen tragen zur Genauigkeit der bipolaren Spindelbildung bei8. Zentriolen gehen jedoch während der frühen Oogenese bei verschiedenen Arten verloren, einschließlich Nagetieren9. Daher nehmen Mauseizellen einen zentriolenunabhängigen Spindelanordnungsweg unter Verwendung zahlreicher acentriolarer Mikrotubuli (MT) Organisationszentren (MTOCs) an9,10. Nach der meiotischen Wiederaufnahme durchlaufen die perinukleären MTOCs drei verschiedene Schritte der Rekondensation, Dehnung und Fragmentierung in eine große Anzahl kleinerer MTOCs11,12. Die fragmentierten MTOCs werden dann gruppiert und sortiert, um eine bipolare Spindel10,13,14 zu organisieren. Ein weiterer Pool von MTOCs befindet sich während der NEBD im Zytoplasma. Einige dieser zytoplasmatischen MTOCs wandern und bilden Spindelpole (polare MTOCs, pMTOCs)10,11. Kürzlich wurde eine weitere Untergruppe zytoplasmatischer MTOCs entdeckt, die als metaphastische zytoplasmatische MTOCs (mcMTOCs) bezeichnet werden, die nicht zur Spindelpolbildung beitragen, sondern während der Metaphase I (Met I) im Zytoplasma der Eizellen verbleiben15. Die Depletion von mcMTOCs durch Multiphotonen-Laserablation oder abnorme Erhöhung ihrer Anzahl durch Autophagiehemmung stört die Positionierung und Migration der Spindel und erhöht die Inzidenz von Aneuploidie in Metaphase-II-Oozyten15.
Interessanterweise unterscheiden sich mcMTOCs in vielerlei Hinsicht von pMTOCs15. Im Gegensatz zu pMTOCs, die hauptsächlich aus perinukleären MTOCs stammen, stammen mcMTOCs beispielsweise aus dem Eizellkortex. Wenn sich die Spindel noch im Zentrum der Eizelle befindet, sind die mcMTOCs asymmetrisch gegenüber der Seite lokalisiert, zu der die Spindel für die PB-Extrusion15 wandert. Astralähnliche MTs können den Kortex in der relativ großen Eizelle nicht erreichen. Daher kernen diese mcMTOCs MTs, um die Spindel (über astralähnliche MTOCs) im Kortex zu verankern. Diese Ergebnisse deuten auf ein Modell hin, in dem die mcMTOC-kernhaltige MT-Kraft der F-Aktin-vermittelten Kraft entgegenwirkt, die die Spindelmigration in Richtung Kortex antreibt. Das Gleichgewicht zwischen diesen beiden entgegengesetzten Kräften ist wesentlich, um die zentrale Spindelpositionierung und die rechtzeitige Spindelmigration zu regulieren15.
Bisher lokalisieren alle untersuchten PMC-Proteine (Pericentrin, g-Tubulin, Cep192 und Aurora-Kinase A) in beiden MTOC-Pools: mcMTOCs und pMTOCs15. Daher gibt es keinen chemischen oder genetischen Ansatz, um mcMTOCs selektiv zu stören, ohne pMTOCs zu stören. Diese Einschränkungen können umgangen werden, indem die mcMTOCs selektiv mit Laserablation anvisiert werden. Unter den laserbasierten Technologien, die für die Mikroablation entwickelt wurden, zeigen gepulste Multiphotonen-Femtosekundenlaser ein großes Potenzial aufgrund ihrer auf die Fokusebene beschränkten Präzisionswirkung, der hohen Eindringtiefe des nahinfraroten Lichts und der reduzierten Phototoxizität und thermischen Schädigung der Zelle16,17,18. Diese Arbeit beschreibt einen selektiven Ansatz zur Ablation von mcMTOCs in Mauseizellen unter Verwendung eines Multiphotonenlasers, der an ein inverses Mikroskop gekoppelt ist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID</td>
			<td>World precision instrument&#160;</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Injection needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass&#160;</td>
			<td>Fisherbrand&#160;</td>
			<td>Cat# 13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillarities&#160;</td>
			<td>World Precision Instrument&#160;</td>
			<td>Cat# TW100-6</td>
			<td>Holding needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope</td>
			<td>Life Imaging Services GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chlrode dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 controller&#160;</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0506.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Cover HP</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0506.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# L7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMi8</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet 4i</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microinjector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# 1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish&#160;</td>
			<td>Mat Tek Corporation</td>
			<td>Cat# P35G-1.0-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Sodium Salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat # H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell vios 160i</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B</td>
			<td>Leica Microsystems, Inc</td>
			<td>N/A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat#G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# M7774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCH-Cep192 cRNA</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Essential Medium Eagle - MEM</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat #M0258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# M5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium eagle (MEM)</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# M0268 - 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Fisherbrand&#160;</td>
			<td>Cat# FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm)</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>Cat# 430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 mm)</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>Cat# 351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone (PVP)</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare&#180;s serum gonadotropin&#160;</td>
			<td>Lee BioSolutions</td>
			<td>Cat# 493-10-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sewing needles&#160;</td>
			<td>D.M.C</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N&#176; 5 * 16 Needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top heating insert P</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0426.300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterezoom S9i</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stereomicroscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD company&#160;</td>
			<td>Cat# 309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0503.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cube temperature controller for the cage incubator</td>
			<td>Life Imaging Services GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon laser ablation of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes

Die Treue der Eizellmeiose ist entscheidend für die Erzeugung entwicklungskompetenter euploider Eizellen. Bei Säugetieren erfährt die Eizelle in der Prophase I der ersten meiotischen Teilung einen längeren Arrest. Nach der Pubertät und bei der meiotischen Wiederaufnahme zerlegt sich die Kernmembran (Kernhüllenzusammenbruch), und die Spindel wird hauptsächlich im Zentrum der Eizellen zusammengesetzt. Die anfängliche Positionierung der zentralen Spindel ist unerlässlich, um vor abnormalen Kinetochor-Mikrotubuli (MT)-Anhaftungen und Aneuploidie zu schützen. Die zentral positionierte Spindel wandert zeitkritisch in Richtung Kortex, und dies ist ein notwendiger Prozess, um einen winzigen Polkörper zu extrudieren. In mitotischen Zellen beruht die Spindelpositionierung auf der Interaktion zwischen zentrosomenvermittelten astralen MTs und dem Zellkortex. Im Gegenteil, Mauseizellen fehlen klassische Zentrosomen und enthalten stattdessen zahlreiche acentriolare MT-Organisationszentren (MTOCs). Im Metaphase-I-Stadium haben Maus-Eizellen zwei verschiedene Sätze von MTOCs: (1) MTOCs, die gruppiert und sortiert sind, um Spindelpole (polare MTOCs) zusammenzusetzen, und (2) metaphastische zytoplasmatische MTOCs (mcMTOCs), die im Zytoplasma verbleiben und nicht direkt zur Spindelbildung beitragen, aber eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Spindelpositionierung und der rechtzeitigen Spindelmigration spielen. Hier wird eine Multiphotonen-Laserablationsmethode beschrieben, um endogen markierte mcMTOCs in Eizellen von Cep192-eGfp-Reportermäusen selektiv abzubauen. Diese Methode trägt zum Verständnis der molekularen Mechanismen bei, die der Positionierung und Migration der Spindel in Säugetiereizellen zugrunde liegen.

Die Multiphotonen-Laserablation bietet eine effiziente Methode, um intrazelluläre Strukturen selektiv abzutragen. Die aktuelle Studie verwendete Multi-Photonen-Laserablation, um mcMTOCs in Maus-Eizellen selektiv abzubauen. Die Laserablation dezimierte die mcMTOCs effizient, wie die Reduktion der endogenen GFP-Fluoreszenz in den angestrebten mcMTOCs auf ein mit dem Hintergrund vergleichbares Niveau zeigt. Exogenes mCh-Cep192 in den anvisierten mcMTOCs wurde ebenfalls nach Laserablation abgeschafft. Die Laserablation von mcMTOCs sollte auf verschiedenen Fokusebenen innerhalb der Eizelle durchgeführt werden (wo sich mcMTOCs befinden, Abbildung 2), um sicherzustellen, dass alle mcMTOCs innerhalb der Eizelle erschöpft sind (Abbildung 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig01.jpg"> Abbildung 1: Mikroinjektion von Eizellen. Mikroinjektion einer Prophase-I-blockierten Mauseizelle mit mCh-Cep192 cRNA. Maßstabsleiste: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig02.jpg"> Abbildung 2: Depletion von mcMTOCs in Maus-Eizellen. Repräsentative Bilder einzelner Fokusebenen. Die weißen Quadrate zeigen eine mcMTOC vor und nach der Multiphotonen-Laserablation an. Maßstabsleiste: 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig03.jpg"> Abbildung 3: Depletion von mcMTOCs auf verschiedenen Fokusebenen in einer Mauseizelle. Repräsentative Maximalprojektionsbilder einer mcMTOC-ablatierten Mauseizelle. Maßstabsleiste: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzungsdatei 1: Kompositionen von Chatot, Ziomek und Bavister (CZB) und bikarbonatfreiem minimal essential medium (MEM/PVP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes at JoVE.com

Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Es wird ein optimiertes Protokoll vorgestellt, das die Depletion zytoplasmatischer Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen während der Metaphase I mit einem Nahinfrarot-Femtosekundenlaser ermöglicht.

Multiphotonen-Laserablation von zytoplasmatischen Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

multi-photon-laser-ablation-cytoplasmic-microtubule-organizing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

1.6K Aufrufe.  University of Missouri. Es wird ein optimiertes Protokoll vorgestellt, das die Depletion zytoplasmatischer Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen während der Metaphase I mit einem Nahinfrarot-Femtosekundenlaser ermöglicht. 

Serie: Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetik

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

Definition des Programms der mütterlichen mRNA-Translation während der In-vitro-Reifung mit einem Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Immunfluoreszenz, Clearing und Multiphotonenmikroskopie des gesamten Eierstocks zur quantitativen 3D-Analyse der sich entwickelnden Ovarialreserve in der Maus

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.

Raumzeitliche subzelluläre Manipulation des Mikrotubuli-Zytoskeletts im lebenden Präimplantations-Mausembryo mittels Photostatinen

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Identifizierung von DNA-Schäden in prophase-arrestierten Eizellen von Mäusen

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Autor im Rampenlicht: Verständnis der DNA-Schadensreaktion in Säugetier-Eizellen und Präimplantationsembryonen 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Multiphotonen-Laserablation von zytoplasmatischen Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Definition des Programms der mütterlichen mRNA-Translation während der In-vitro-Reifung mit einem Single Oocyte Reporter Assay

Immunfluoreszenz, Clearing und Multiphotonenmikroskopie des gesamten Eierstocks zur quantitativen 3D-Analyse der sich entwickelnden Ovarialreserve in der Maus

Raumzeitliche subzelluläre Manipulation des Mikrotubuli-Zytoskeletts im lebenden Präimplantations-Mausembryo mittels Photostatinen

Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung