Bevor Sie den sterilisierten Schlauch mit dem Biochip verbinden, spülen Sie den Schlauch zuerst mit 200 Mikrolitern PBS, gefolgt von 200 Mikrolitern EC-Medium. Nachdem Sie die obere und untere Kammer mit frisch vorbereitetem Zellkulturmedium gespült haben, setzen Sie das Reservoir auf der Auslassseite des Biochips ein und verbinden Sie das Reservoir mit dem Schlauch mit dem Einlass des Biochips. Verbinden Sie den Schlauch mit dem Reservoir und dem Biochip, um ein kreisförmiges Medium zu erhalten.
Füllen Sie nun den Behälter mit 500 Mikrolitern EC-Medium. Verbinden Sie den Biochip mit dem Schlauch, um mit einer Durchflussrate von 21 Mikrolitern pro Minute zu beginnen. Stoppen Sie am nächsten Tag den Überfluss und leeren Sie die Reservoirs.
Pipettieren Sie unter einer sterilen Sicherheitswerkbank 500 Mikroliter EC-Medium in die Reservoire und spülen Sie die untere Kammer vorsichtig mit 200 Mikrolitern RPMI plus Medium aus. Starten Sie dann die Perfusion mit einer Durchflussrate von 21 Mikrolitern pro Minute neu. Um eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche von Tag 12 bis Tag 14 zu etablieren, öffnen Sie die Stopfen an der unteren Kammer und saugen Sie das Medium vorsichtig auf, bis eine Luftblase sichtbar ist.
Nachdem Sie sichergestellt haben, dass alle Flüssigkeiten aus dem Kanal und der Kammer entfernt wurden, schließen Sie vorsichtig die Öffnungen, füllen Sie das Reservoir mit frisch zubereitetem Gefäß-EC-Medium und setzen Sie die Profusionskultur nur in der oberen Kammer bis zum 14. Tag fort. Trennen Sie die Biochips vom Durchflusssystem. Untersuchen Sie nach dem Entfernen des Schlauchs die Zellschichten des Biochips unter einem Mikroskop auf Zellkonfluenz.
Waschen Sie die Hohlräume der Biochips mit PBS, um das Zellkulturmedium zu entfernen. Geben Sie 300 Mikroliter 4%ige Paraformaldehydlösung in PBS in die obere Kammer und 200 Mikroliter in die untere Kammer. Waschen Sie die Kammer nach 10 Minuten Inkubation dreimal mit PBS.
Für die Permeablation 300 Mikroliter 0,25 % Triton X 100 in PBS zugeben und 30 Minuten inkubieren, nach dem Waschen mit PBS 300 Mikroliter 3 % Rinderserumalbumin in PBS in beide Kammern pipettieren und eine Stunde lang inkubieren. Für die Immunfluoreszenzfärbung sind 50 Mikroliter Antikörperlösungen mit 3 %BSA für jede Membran unter Verwendung geeigneter Verdünnungsverhältnisse herzustellen. Um an die Zellen innerhalb des Biochips zu gelangen, machen Sie einen exakten Schnitt an der Außenseite des Hohlraums und entfernen Sie die Klebefolie.
Schneiden Sie die Membran mit einem Skalpell heraus, indem Sie die mit dem Biochip versiegelten Kanten entfernen. Nachdem Sie die Membran in zwei Stücke geteilt haben, sammeln Sie die Membranstücke mit einer Pinzette und legen Sie sie zum Färben auf einen mikroskopischen Objektträger, geben Sie 50 Mikroliter Antikörperlösung zu jedem Membranstück und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius, um sie vor Licht zu schützen. Nachdem Sie die Membran dreimal mit PBS gewaschen haben, geben Sie einen Tropfen Einbettmedium auf den beschrifteten Objektträger und platzieren Sie die entsprechende Membran.
Geben Sie einen Tropfen des Einbettmediums auf die Oberseite der Membran und platzieren Sie ein Deckglas. Die Immunfluoreszenzfärbung von humanen Endothelzellen der Nabelschnurvene zeigte morphologische Veränderungen und die Markoproteinexpression nach 14-tägiger Co-Kultur. Auf der vaskulären Seite deutete die kohärente V-Expression an den Endothelzellgrenzen auf Konfluenz und Endothelbarrierebildung hin.
Die epitheliale Seite wurde auf die Expression von Ecaherrin und Surfactant Protein A untersucht, die auf die Integrität und Funktion des Alveolarepithels hinweist.
