Unser Protokoll erweitert die Verwendung von G.mellonella von einem systemischen Infektionsmodell zu einem Modell, das die bakterielle Verabreichung über den natürlichen oralen Weg ermöglicht. G.mellonella ist ein geeignetes Ersatzmodell für Nagetiere bei der Analyse verschiedener Merkmale angeborener Mikro-Post-Wechselwirkungen, da die Larven für menschliche pathogene Bakterien verwendet werden können. Beginnen Sie damit, die von erwachsenen Motten gelegten Eier in zwei Liter-Boxen mit Wachsmottensubstrat, bei 30 Grad Celsius, im Dunkeln zu übertragen.
Nach ein bis zwei Wochen 25 Gramm Larven substrathaltiges Substrat in frisches Substrat übertragen, wenn kleine und winzige Larven sichtbar werden. Synchronisieren Sie die Larven nach zwei Wochen nach ihrer Größe, in Gruppen von 30 bis 40 Larven in neuen Zwei-Liter-Behältern auf Wachsmotten substrat. Nach zwei Wochen Larven für das Experiment nach Gewicht auswählen.
Mit nur blassen, schnell bewegenden Larven mit einer Masse von 180 bis 200 Milligramm. Um die Larven zu füttern, laden Sie eine Insulinspritze mit einer stumpfen Nadel zur oralen Anwendung, mit einem mal 10 bis zum siebten Bakterium pro 10 Mikroliter DPBS pro Larve. Laden Sie die Spritze in eine Mikrospritzepumpe.
Warten Sie, bis eine Larve ihre Mundpartien öffnet, bevor sie die Spritze vorsichtig zwischen den Unterkiefern einlegt und die Bakterien liefert. Wenn alle Larven gefüttert wurden, bebrüten die Tiere im Dunkeln bei 37 Grad Celsius, zwischen ein und 24 Stunden. Reinigen Sie für die Larvenverarbeitung eine Sicherheitshaube mit Ethanol und Sprühreagenz, um eine RNase-Kontamination zu verhindern.
Fangen Sie die lebende Larve in flüssigem Stickstoff ein. Homogenisieren Sie jede einzelne gefrorene Larve mit einem Mörtel und Stößel und einem kleinen Volumen an flüssigem Stickstoff. Wenn ein pulverförmiges Homogenat hergestellt wurde, das Homogenat auf ein Einweg-Warteboot übertragen und warten, bis der flüssige Stickstoff verdampft.
Wenn alle Larven homogenisiert sind, mischen Sie die pulverisierten Homogenate mit einem Milliliter TRIzol in einem Zwei-Milliliter-Rohr. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für eine Stunde. Am Ende der Inkubation wird das Homogenat durch Zentrifugation gepelt.
Übertragen Sie den Überstand in eine neue Röhre. Mischen Sie den Überstand mit 200 Mikroliter n. 1-Bromo-3-Chlorpropan oder BCP. Wirbel und inkubieren für fünf Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation auf Eis.
Am Ende der zweiten Inkubation fügte die Zentrifuge die BCP reaktionswichtig hinzu und überträgt die obere transparente Schicht in ein neues, zwei Milliliter-Rohr. Die RNA der übertragenen oberen Schicht mit 500 Mikroliter Isopropanol durch Mischen und Invertieren der Röhre für fünf Minuten ausfälten. Dann sammeln Sie die ausgefällte RNA durch Zentrifugation.
Waschen Sie das gefällte RNA-Pellet mit 500 Mikrolitern 75%Ethanol und trocknen Sie die RNA fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur. Wenn das Ethanol verdampft ist, 100 Mikroliter Ribonuklease-Inhibitor in nukleasefreies Wasser in das getrocknete RNA-Pellet geben und das Rohr vorsichtig wirbeln, bis das Pellet vollständig gelöst ist. Messen Sie die RNA-Qualität und -Menge anhand von Standardprotokollen, um sicherzustellen, dass das Verhältnis von 260 zu 280 ungefähr zwei beträgt und das Verhältnis 260 zu 230 im Bereich von zwei bis 2,2 liegt.
Verwenden Sie dann fünf Mikrogramm der isolierten RNA für die DNase-Verdauung und Genexpressionsanalyse, nach Standardprotokollen. G.mellonella ist in der Lage, die anfängliche Kraft zugeführt bakterielle Last zu löschen, bis keine Bakterien nachweisbar sind. Mit den 16s-Genkopie-Zahlen von B.vulgatus und E.coli innerhalb von 24 Stunden deutlich zurückgegangen.
Commensal verabreichte eine G.mellonella Larven induzieren RNA-Genexpression von verschiedenen angeborenen Immunität Marker Gene. Zum Beispiel werden die LPS-Erkennungsmoleküle, Apolipophorin und Hemolin im Allgemeinen stärker in den E.coli-verabreichten Larven exprimiert als b.vulgatus verabreichte Larven. Darüber hinaus ist die Produktion von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffarten stark auf E.coli-Kraftfütterung im Vergleich zu B.vulgatus sowie antioxidative GST-Genexpression hochreguliert.
Darüber hinaus wird die differenzielle mikrobielle Peptidexpression nach der E.coli-Verabreichung stärker induziert als als Reaktion auf die B.vulgatus-Zwangsfütterung. Denken Sie daran, nur gesunde, weiße, sich schnell bewegende Larven zu verwenden, um Geduld während der Zwangsfütterung zu verwenden, um stressen die Larven zu vermeiden und alle notwendigen Kontrollen einzubeziehen. Die Aktivierung von G.mellonella Immunmarkern kann direkt durch RUS- oder GST-Aktivitätstests bestimmt werden und die Fülle von ANPs kann durch bakterielle Wachstumsinhibitionstests bestimmt werden.
Diese Technik kann als Screening-Tool für kominsale und pathogene Bakterien und zur Erforschung von Darmsymbiome und Pathobiome nein, ohne Opfer vieler Wirbeltiere zu werden. Verwenden Sie immer die entsprechende persönliche Schutzausrüstung, wenn Sie mit flüssigem Stickstoff, BCP oder TRIzol-Stoffen arbeiten.
