Entnehmen Sie zunächst zwei Kryokonservierungsröhrchen mit gefrorenen mesenchymalen Stammzellen aus menschlichem Fettgewebe an der dritten Passage aus flüssigem Stickstoff. Rühren Sie sie in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad, bis sie vollständig aufgetaut sind. Desinfizieren Sie dann die Röhrchen mit 75%igem Alkohol.
Legen Sie die desinfizierten Röhrchen auf einen ultrasauberen Tisch. Aspirieren Sie die Zellsuspension mit einer Pipette und überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Das Röhrchen wird in einer Zentrifuge mit niedriger Drehzahl bei 250 g und vier Grad Celsius fünf Minuten lang zentrifugiert.
Bereiten Sie in der Zwischenzeit vier 10-Zentimeter-Kulturschalen vor und fügen Sie neun Milliliter Medium zu jeder Schale hinzu. Markieren Sie den Namen, den Zelltyp, die Generation und das Versuchsdatum auf jeder Schale. Anschließend werden sie in einem thermostatischen Inkubator bei 37 Grad Celsius vorgeheizt.
Sobald die fünfminütige Zentrifugation beendet ist, desinfizieren Sie das Zentrifugenröhrchen, bevor Sie es auf einen ultrareinen Tisch stellen. Entfernen Sie mit einer Pipette den Überstand und fügen Sie vier Milliliter Medium hinzu, um die gewünschte Zellkonzentration zu erreichen. Rühren Sie die Lösung vorsichtig um, bis sie gleichmäßig verteilt ist.
Geben Sie dann einen Milliliter Zellsuspension in jede vorgeheizte Schüssel und schütteln Sie sie, indem Sie sie auf einer ebenen Fläche in einem Kreuzmuster umrühren. Beobachten Sie die Zellen bei 40-facher Vergrößerung unter einem optischen Mikroskop, bevor Sie die Schalen in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator legen. Beobachten Sie am zweiten Tag den Zellzustand unter dem Lichtmikroskop bei 40-facher Vergrößerung, bevor Sie mit der Vorbereitung des Austauschmediums fortfahren.
Bringen Sie die Kulturschalen nach der Desinfektion auf einen ultrareinen Tisch mit Biosicherheitsstufe 2. Entfernen Sie das Medium aus jeder Kulturschale. Spülen Sie die Schale zweimal vorsichtig mit zwei Millilitern PBS-Lösung aus und geben Sie 10 Milliliter Medium in jede Schüssel.
Übertragen Sie die Zellen in den Inkubator, bis sie für die Entnahme von Überständen bereit sind.
