Unsere exogenfreie Methode zur Isolierung und In-vitro-Expansion von aus menschlichem Fett gewonnenen Stammzellen ist die Antwort auf die Bedenken hinsichtlich der biologischen Sicherheit im Zusammenhang mit der Zelltherapie, wenn sie für eine translationale Anwendung in Betracht gezogen wird. Unsere Isolations- und Erweiterungsmethoden sind einfach zu replizieren, schnell und haben geringe technische Anforderungen, so dass sie für jeden nützlich sind. Wir untersuchen eine auf humanen Fettstammzellen basierende Therapiestrategie für die Reparatur peripherer Nerven.
Unsere Technik kann jedoch weit verbreitet sein, wenn neue Fettstammzellen in verschiedenen klinischen Forschungseinrichtungen benötigt werden. Wir haben es einfach gehalten, um eine einfachere Produzierbarkeit zu erhalten. Die Sterilität sollte vom Operationssaal bis zur Zellkultur sorgfältig beobachtet werden.
Bei der Probenmanipulation und bei der Fragmentierung besteht bei der Mikrodissektion die Gefahr einer Kontamination. Nachdem Sie die Fettgewebsprobe aus der plastischen Bauchchirurgie erhalten haben, schneiden Sie sie mit einer sterilen Schere in Stücke von etwa einem Quadratzentimeter. Zerlegen Sie jedes Stück mit einem Skalpell in kleinere Fragmente und verteilen Sie fünf Fragmente in einer 10 cm langen Petrischale.
Verwenden Sie zum Anheften von Fragmenten ein Skalpell, um Einschnitte auf der Kunststoffoberfläche zu erzeugen, und ziehen Sie jedes Fragment. Fügen Sie vorsichtig 10 Milliliter vollständiges Nährmedium hinzu, um alle Fragmente zu bedecken, ohne sie abzulösen, und inkubieren Sie die Petrischale bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Überwachen Sie die Expansion der aus menschlichem Fett gewonnenen Stammzellen (HASC) täglich unter einem optischen Mikroskop, bis die Zellen konfluent werden.
Ersetzen Sie das Medium alle 72 Stunden durch ein frisches, vollständiges Medium, um Zellreste zu entfernen, und lassen Sie sie bis zum ersten Durchgang wachsen. Sobald die HASC-Kultur 70 bis 80 % Konfluenz erreicht hat, entfernen Sie alle Gewebestücke und entsorgen Sie sie mit einer sterilen Pinzette. Entsorgen Sie auch das erschöpfte Medium, um zu vermeiden, dass sich der HASC von der Petrischale löst.
Waschen Sie die Zellen sorgfältig mit 10 Millilitern PBS. Fügen Sie nach dem Entfernen von PBS einen Milliliter tierfreies Trypsin hinzu und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Überprüfen Sie die Zellablösung unter einem optischen Mikroskop und inkubieren Sie bei Bedarf zwei weitere Minuten.
Um die Zellablösung zu unterstützen, klopfen Sie vorsichtig auf die Kunststoffoberfläche. Stoppen Sie die Trypsin-Wirkung, indem Sie zwei Milliliter des vollständigen Mediums hinzufügen und alle Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen sammeln. Entfernen Sie das restliche Trypsin durch Zentrifugation.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter vollständigem Medium und überführen Sie die Zellsuspension in einen neuen T25-Kolben. Für die Kryokonservierung zählen Sie ein Aliquot der abgelösten Zellen mit dem Zellzähler unter einem optischen Mikroskop. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 G.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie die Zellen in der Gefriermischung mit einer Dichte von eins mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter und überführen Sie einen Milliliter der Zellsuspension in ein Kryofläschchen. Legen Sie die Kryofläschchen bei minus 80 Grad Celsius in einen Gefrierbehälter, der die Temperatur um ein Grad Celsius pro Minute senkt, und stellen Sie die Kryofläschchen dann zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff. In der anfänglichen Cluster-Erscheinung zeigten die HASCs eine klassische spindelartige Form und waren kleiner sowie länglicher im Vergleich zu den Kontrollzellen in Gegenwart von FBS.
Der Immunphänotyp der Zellen schien zwischen den HASCs, die mit den beiden Ergänzungen kultiviert wurden, ähnlich zu sein. Mehr als 80 bis 90 % der HASCs waren positiv für CD73 und CD105 und weniger als 5 % für CD34 und CD45. Schließlich zeigte der Proliferationstest einen signifikanten Anstieg des Zellwachstums, wenn dem Medium humanes Thrombozytenlysat zugesetzt wurde, verglichen mit der FBS-Kontrolle.
Der wichtigste Schritt ist die Mikrodissektion von Fettfragmenten und deren Befestigung mit einem Skalpellschnitt an der Petrischale. Unter Berücksichtigung der GMP-Biosicherheitskriterien wird eine gebrauchsfertige Stammzellpopulation aus menschlichem Fett erhalten, die die therapeutischen Zelleigenschaften beibehält und die Zellproliferation fördert.
