Zu Beginn entnehmen Sie den Überstand aus der aus menschlichem Fett gewonnenen mesenchymalen Stammzellkultur, sobald die Zellen zu 80 % konfluiert sind. Den Überstand vorsichtig mit einer Pipette auffangen und in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umfüllen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um suspendierte Zellen zu entfernen, und verwenden Sie dann eine Pipette, um den Überstand aufzufangen, ohne das Pellet zu stören.
Zentrifugieren Sie den Überstand bei 2000 x g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um Zelltrümmer zu entfernen. Sammeln Sie den resultierenden Überstand mit einer Pipette und filtrieren Sie ihn durch eine 0,22-Mikron-Membran, um große Partikel und Zelltrümmer zu entfernen. Das Filtrat wird 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 10.000 x g ultrazentrifugiert.
Führen Sie dann eine abschließende Zentrifugation bei 100.000 x g für 70 Minuten bei vier Grad Celsius durch. Entfernen Sie mit einer Pipette den Überstand, ohne das Pellet aufzufangen. Resuspendieren Sie das Pellet in PBS, bevor Sie das Röhrchen bei 100.000 x g für 70 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das erhaltene Pellet aus extrazellulären Vesikeln oder EVs in einem Milliliter PBS. Übertragen Sie schließlich die EV-Suspension in ein Ein-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und lagern Sie sie bis zur weiteren Analyse bei vier Grad Celsius. Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigte deutlich die becherförmige Struktur der EVs mit einer Doppelschichtmembran.
Die Analyse der Nanopartikelverfolgung ergab, dass sie eine Partikelgrößenverteilung von etwa 50 bis 150 Nanometern aufweisen. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die charakteristischen Markerproteine von EVs reibungslos exprimiert wurden.
