Beginnen Sie mit der Resuspendierung der mitochondrialen Fraktionen, die aus Säugetierzellkulturen oder -geweben in blauem nativem Probenpuffer gewonnen wurden, um eine Proteinkonzentration von etwa 10 Milligramm pro Milliliter zu erhalten. Um mitochondriale Membranen zu lösen, fügen Sie Digitonin hinzu, um ein Verhältnis von vier Gramm Digitonin pro Gramm mitochondrialem Protein zu erhalten. Mischen Sie durch sanftes Pipettieren und inkubieren Sie es fünf Minuten lang auf Eis.
Die Suspension wird in einer Mikrofuge bei 20.000 g für 25 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand in einem frischen Röhrchen, fügen Sie dann 5 % Coomassie blue G-250 hinzu, was einem Drittel des ursprünglichen Resuspensionsvolumens entspricht, und mischen Sie durch Pipettieren. Geben Sie den Kaltkathoden-A-Puffer in die obere Kammer des Elektrophoresegeräts und den Anodenpuffer in die untere Kammer.
Laden Sie 30 bis 100 Mikrogramm mitochondriales Protein in die Vertiefungen auf ein Polyacrylamid-Gel. Geben Sie das Gel nach der Elektrophorese in eine Plastikbox. Geben Sie genügend Volumen der geeigneten Gelaktivitäts-Assay-Lösung hinzu, um das Gel zu bedecken, und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln unter Schutz vor Licht.
Wenn sich die entsprechenden Banden gebildet haben, entfernen Sie die Testlösung. Waschen Sie das Gel zweimal mit destilliertem Wasser, bevor Sie es 30 Minuten lang mit 40 % Methanol und 10 % Essigsäure fixieren. Die Analyse von Gelaktivitätsassays zeigte unterschiedliche Assemblierungsmuster von Superkomplexen in Mäusen und menschlichen Zellen.
Der freie Komplex 1 wurde in Mauszellen beobachtet, während er in menschlichen Mitochondrien nicht nachweisbar war. Die Muster von Komplex 4 waren in menschlichen Zelllinien ähnlich, variierten jedoch in Mauszelllinien aufgrund einer mutierten Variante von SCAF1.
