Nachdem Sie die Lungenprobe mit T-Zellen angereichert haben, fügen Sie jeder Probe einen Milliliter 10 millimolare Dasatinib hinzu. Die Mischung einreiben und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Das PE- oder APC-konjugierte Peptid MHC-Tetramer wird bis zu einer Endkonzentration von 10 Nanomolaren zugegeben.
Nachdem Sie die Mischung vortext haben, inkubieren Sie sie eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Während die Probe mit Peptid-MHC-Tetrameren gefärbt wird, bereiten Sie einen Mastermix aus Antikörpern vor, um die Zelloberflächenmarker mit 15 Minuten verbleibender Inkubationszeit für die Tetramerfärbung zu färben, und fügen Sie den Oberflächenantikörper-Mastermix in einer Verdünnung von 1 bis 100 zu. Fügen Sie 50.000 Durchflusszytometrie-Kügelchen und einen Kaltsortierpuffer hinzu, um ein Endvolumen von etwa fünf Millilitern zu erreichen, fügen Sie dann einen Kaltsortierpuffer auf ein Volumen von 15 Millilitern hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 400 x g bei vier Grad Celsius.
Saugen Sie den Überstand vorsichtig an, wobei etwa 100 Mikroliter des Überstands und des Zellpellets übrig bleiben. Resuspendieren Sie nun die Probe mit weiteren 200 Mikrolitern Sortierpuffer und überführen Sie sie in ein Fünf-Milliliter-FACS-Röhrchen.
