Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) und KFO 146 (MF) unterstützt, der DOD-Verteidigungsministerium Zuschuss PC 040972 (MO) und das National Institute of Health gewährt RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)

1. Erzeugung von HLA-A2-Ig-Based KaAPC <ol><li> Bereiten Sie sterile Boratpuffer. Machen Sie eine 0,1 M Lösung von Borsäure in Wasser und den pH-Wert auf 7,0. Sterilfilter (0,22 um) zu puffern und bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie sterile Wulst Waschpuffer. Verwenden phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Magnesium und Calcium. Hinzufügen humanem AB-Serum für 3% Endkonzentration. Hinzufügen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 2 mM Endkonzentration. Natriumazid (NaN 3) für 0,01% Endkonzentration. Sterilfilter (0,22 um) zu puffern und bei 4 ° C. </li><li> Transfer 250 ul Epoxy-Perlen (ca. 100 x 10 6 Perlen) ab Lager in einen sterilen, mit Schraubverschluss-Glasfläschchen. </li><li> Fügen Sie 250 ul Boratpuffer. </li><li> Setzen Glasfläschchen auf einem Magneten und lassen Perlen für 2 min zu halten; absaugen Puffer und entfernen Glasfläschchen von Magneten. </li><li> Einmal zu waschen Perlen mit 1 ml Boratpuffer. </li><li> Resuspendieren Perlen in 550 ul von 0,018 ug/ Ml HLA-A2-Ig und 3,64 g / ml anti-CD95 mAb Mensch (Klon CH11) und vorsichtig durch Schütteln. (Siehe Diskussion Abschnitt für weitere Informationen.) </li><li> Inkubieren Glasfläschchen auf einem Rotator über Kopf, bei 4 ° C für 24 Stunden. </li><li> Spin-Down-Perlen bei 300 g für 2 min. </li><li> Zeigen Glasfläschchen auf einem Magneten für 2 min und saugen Sie den &quot;KaAPC Beladungslösung&quot;; entfernen Glasfläschchen von Magneten, 1 ml Waschpuffer Wulst und sorgfältig resuspendieren durch Schütteln. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.10 zweimal. </li><li> Inkubieren Glasfläschchen auf einem Rotator bei 4 ° C für 24 h in 1 ml Waschpuffer Wulst. An diesem Punkt werden alle restlichen Proteinbindungsstellen von humanem AB-Serum in dem Wulst Waschpuffer enthielt blockiert werden. </li><li> Spin-Down-Perlen bei 300 g für 2 min. </li><li> Ort Glasfläschchen auf einem Magneten für 2 min und saugen Wulst Waschpuffer; entfernen Glasfläschchen aus Magnet und ersetzen Lösung mit 1 ml PBS. </li></ol> 2. Qualitätskontrolle, die Peptid-Beladung, WVeraschung, Lagerung und Stabilität von KaAPC <ol><li> Übertragen 1,5 x 10 5 KaAPC in ein FACS-Röhrchen und wäscht mit 1 ml FACS-Waschpuffer. </li><li> Resuspendieren Perlen in 100 ul FACS-Waschpuffer und mit 1 ul Anti-Maus-IgG1-PE (zum Nachweis der Fc-Teil des HLA-A2-Ig) und 1 ul Anti-Maus-IgM-FITC (Klon R6-60.2 zum Nachweis der Anti-Human-CD95 mAb). </li><li> Die Proben für 15 min bei 4 ° C, waschen mit 1 ml FACS-Waschpuffer und Resuspension in 250 ul FACS Waschpuffer und lesen Färbung mittels Durchflusszytometrie. </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. QC Fleck eines KaAPC Batch gemacht, wie in der Protokollabschnitt angegeben. Färbung wurde wie in Protokoll Abschnitt beschrieben durchgeführt 2. HLA-A2-Ig wurde mit einem Anti-Maus-IgG1 PE mAb detektiert, während anti-human-CD95 (Anti-Fas) wurde mit einem Anti-Maus-IgM-FITC mAb erkannt (siehe Protokoll SEction 2.2) (blaue Linie). Gefüllt schwarz Graphen stellen leer Perlen mit Anti-Maus-IgG1 PE mAb oder Anti-Maus-IgM-FITC mAb bzw. gefärbt. Die Zahlen in der oberen rechten Ecke geben den mittleren Fluoreszenzintensität (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="4"><li> Für Peptidbeladung Transfer 20 x 10 6 KaAPC in eine neue sterile Glasflasche, auf einem Magneten Platz für 2 min, PBS absaugen und resuspendieren Perlen in 500 ul frischem PBS mit 5 ug Peptid (Denken Sie daran, wird nur HLA-A2-restringierte Peptide auf das Dimer binden!). </li><li> Speicher geladen KaAPC bei 4 ° C bis zur Verwendung, für mindestens 3 Tage, um eine ausreichende Peptidbeladung auf HLA-A2-Ig-Dimer zu ermöglichen. </li><li> Unmittelbar vor der Verwendung, waschen Sie die Peptid beladen KaAPC wie in 1.14 angegeben; wiederholen Sie diesen Schritt mindestens 6x. Hinweis: Dies ist ein entscheidender Schritt, um sicherzustellen, dass freie Peptid to vollständig entfernt werden, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden Tötung; restliche freie Peptid wurde gezeigt, dass Apoptose in Antigen-spezifischen T-Zell-Kulturen 9 induzieren. Um auszuschließen, die eine lösliche Peptid-Effekt, führen Überstand Kontrollproben von Peptid beladen und gewaschen KaAPC (siehe 3.8). </li><li> Graf Perlen mit Zählkammer und beschriften mit Datum, Name des Peptids und Konzentration. ANMERKUNG: geladenen KaAPC funktionsfähig bleiben bei 4 ° C für mindestens einen Monat. Nach einem Monat Nachladen mit dem gleichen Peptid ermöglicht KaAPC für bis zu einem Jahr verwendet werden. </li></ol> 3. KaAPC In-vitro-Assay Töten <ol><li> Bereiten Co-Kultur-Medien. Vorbereitung vollständigem RPMI-Medium mit 3% T-Zellwachstumsfaktor und 3% Spender autologem Plasma (im Labor hergestellt 6) ergänzt wird. Wenn Geber autologem Plasma nicht verfügbar ist, verwenden hitzeinaktiviertem humanem AB-Serum. </li><li> Bereiten AnnexinV Bindungspuffer Vorbereitung. Man löst 8,12 g Natriumchlorid (NaCl) und 0,12 g calcium Chlorid (CaCl 2) in 990 ml ddH 2 O.Add 10 ml 1 M HEPES-Puffer. </li><li> Erzeugen einer humanen Antigen-spezifischen T-Zellen. (Für eine ausführliche Protokoll finden Sie in einer früheren Veröffentlichung 7 Verwendung künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (AAPC)). Sicherzustellen, dass Peptidspezifität mindestens&gt; 75%, wie durch Tetramer-Färbung bestimmt. </li><li> Für jede Probe inkubieren 2 × 10 5 Antigen-spezifische T-Zellen / Vertiefung (in einer 96-Well-Rundbodenplatte) in 200 ul Co-Kulturmedium in einem Verhältnis 1: 1 mit KaAPC für 48 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Ernteproben und Transfer in einem FACS-Röhrchen; waschen mit 1 ml Bindungspuffer AnnexinV, drehen bei 300 g für 5 min nach unten, Überstand verwerfen und resuspendieren in 100 ul AnnexinV Bindungspuffer </li><li> Fleck Proben mit 1 ul AnnexinV FITC und 5 ul 7-AAD für 10-15 min bei RT, wäscht mit 1 ml Bindungspuffer AnnexinV; Spin-Down bei 300 g für 5 min, Überstand verwerfen eind Resuspendieren in 250 ul Bindungspuffer Annexin </li><li> Lesen Proben sofort auf Durchflusszytometer. </li><li> Bereiten Sie die folgenden Proben auf Antigen-spezifische Abtötung durch KaAPC bestimmen: nur T-Zellen; + T-Zellen lösliche anti-CD95; + T-Zellen entladen KaAPC; + T-Zellen nicht-verwandten Peptid beladen KaAPC; + T-Zellen verwandten Peptid beladen KaAPC; + T-Zellen Überstand von verwandten Peptid beladen KaAPC. </li></ol><img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . Abbildung 2. KaAPC Abtötungsassay Peptid beladen KaAPC oder Kontrollkügelchen (HLA-A2-Ig nur Kügelchen) wurden für 48 h kultiviert in einem Verhältnis 1: 1 mit CMVpp65 spezifischen T-Zellen (~ 80%), geerntet und anschließend mit Annexin gefärbten und Propidiumiodid (PI), um die Apoptose durch Durchflusscytometrie (siehe Protokoll Schnitt von 3,3 bis 3,7) zu bestimmen. &quot;verwandten&quot; bezieht sich auf Perlen mit CMVpp65 und &quot;nicht-verwandten&quot; werden geladenAnzeigen mit Mart-1 Peptid beladen. Die Zahlen geben den Anteil der lebensfähigen T-Zellen in der linken unteren Quadranten jeder Parzelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="9"><li> Um kreuz-Experimente durchzuführen, zu erzeugen Antigen-spezifischen T-Zellen aus zwei verschiedenen Spezifitäten. </li><li> Die Antigen-spezifische Depletion-Fähigkeiten KaAPC weiter auszuwerten bei gleichzeitiger Analyse der Antigen-spezifischen Eliminierung von T-Zellen in der heterogenen T-Zellpopulation. (Für eine ausführliche Protokoll finden Sie Schütz et al. 10). </li></ol>

<ol>
	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS und MF haben nichts zu offenbaren. Unter einer Lizenzvereinbarung zwischen NexImmune und der Johns Hopkins University, Drs. Schneck und Oelke sind dabei auf Aktien von lizenz von der Universität aus dem Verkauf von in diesem Artikel beschrieben AAPC Produkte erhielten berechtigt. Sie besitzen auch NexImmune Lager, das unter bestimmten Einschränkungen unter Hochschulpolitik ist. Dr. Schneck ist ein Mitglied der Gesellschaft &quot;s Verwaltungsrat und Scientific Advisory Board. Die Bedingungen dieser Vereinbarung werden von der Johns-Hopkins-Universität in Übereinstimmung mit seinen Interessenkonflikt Richtlinien verwaltet.

Der wichtigste Schritt im Protokoll ist das geeignete Verhältnis des Signals 1 (Peptid-MHC) und des Signals 2 (anti-Fas-mAb) zu gewährleisten. Wir haben intensive Titration Experimente durchgeführt, um das perfekte Verhältnis zur Signal 1 und 2 zu definieren; es zeigte sich, dass minimale Abweichungen aufgrund von Unterschieden in der HLA-A2-Ig-Dimer oder Anti-Fas-mAk-Konzentrationen mit der Funktionalität des KaAPC stören. Daher sollte die Konzentration der beiden Signale stets überprüft werden und die Qualität der beiden Proteine ​​ist häufig getestet, auch wenn sie von einer kommerziellen Quelle befohlen werden. Darüber hinaus sollte die Konzentrationen immer durch den gleichen Assay bestimmt, wie verschiedene Nachweisverfahren kann in unterschiedlichen Konzentrationen führt. Funktionalität des HLA-A2-Ig können durch unvollständige Rückfaltung und / oder ineffizient Peptidbeladung beeinträchtigt werden. Weiterhin Dimer-Moleküle können in unterschiedlichem Ausmaß, das auf der funktionellen Aktivität des Proteins beeinflussen könnten, zu aggregieren. Daher ist die versicherungsal Menge an Dimer zur Erzeugung eines funktionalen und spezifische KaAPC variieren benötigt. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass der ideale Bereich für den Tod induzieren Signal anti-Fas-mAb auf KaAPC ist extrem eng. In unseren Händen größeren Mengen 3,64 g / ml, um unspezifische Tötung von Fas-positiven T-Zellen führen, während Mengen unter 3,64 g / ml führte zu einer dosisabhängigen reduziert Tötungsaktivität. Während diese Bedingungen scheinen recht eng sind, wird die Aufmerksamkeit auf diese Details bei der Erzeugung eines funktionellen und spezifische KaAPC führen. Während die Strom KaAPC Phänotyp Funktions zur Abreicherung von aktiviertem Antigen-spezifischen T-Zellen, naiv anfänglichen Experimenten Targeting oder Ruhe Antigen-spezifischen T-Zellen zeigten keine signifikante Induktion von Antigen-spezifischen Apoptose als diese Populationen Fas-Expression reduziert. Daher könnte man sich vorstellen das Hinzufügen eines kostimulatorischen Signals auf den KaAPC, um die Hochregulation von Fas auf ruhenden T-Zellen zu machen, schalten Sie sie induzierenin einem Ziel für den KaAPC. Dies ist zwar möglich alle drei Signale müssen sorgfältig titriert, um einen funktionellen Phänotyp KaAPC gewährleisten. Einstellung der Wulst-Plattform auf eine biokompatible oder bioabbaubare Matrix KaAPC verbessern in vivo Anwendbarkeit. Kürzlich, Shen et al. Haben die erfolgreiche in vivo-Verwendung von KaAPC 5 um unter Verwendung von Latex-Kügelchen, um anti-Fas (Klon Jo2) und Anti-His / H2-K b konjugiert -TRP2 11 gemeldet. Wir waren in der Lage zu zeigen, dass das allgemeine Konzept der künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (AAPC) erfolgreich aus um bis nm großen Partikel 12 Größe übertragen werden und dass Funktionalität wird durch Partikelgeometrie 13 beeinflusst. Somit kann durch Variieren der Größe und / oder Form der zukünftigen KaAPC Designs könnte man sich auf die in vivo-Funktionalität und biologische Verteilung, die die Schlüssel für eine erfolgreiche Behandlung organspezifischer Autoimmunkrankheiten sein könnte Auswirkungen. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC überwinden die großen Mängel der zellbasierten Strategien Erschöpfung als einfache &quot;von der Stange&quot;, Zeit und Kosten effizienter Ansatz, der unabhängig von Spender Zustand und Vorbehandlung zu bedienen ist. KaAPC sind nicht Ziele der Selbsttötung oder parakrine Signalisierung und nicht empfindlich auf zytolytische Effektorfunktionen von CTL. KaAPC wird Identifizierung der betreffenden Krankheit Antigen erfordern und verlassen sich auf ihre spezifischen HLA-Typ. Während derzeit zahlreiche geeignete HLA-A2 beschränkt Antigene für Typ-1-Diabetes, GvHD und Multiples Sklerose identifiziert wurden 2, Entwicklung von zusätzlichen HLA-Klasse-I-Moleküle Dimer sowie die laufende Identifizierung von neuen Autoimmun relevanter Antigene weiter zu erhöhen und erweitern die Anwendbarkeit der KaAPC. Außerdem eine der mit KaAPC an verschiedenen Epitope gerichtet, mehrere Antigene gleichzeitig gezielt denken konnte. Zusammenfassend stellen KaAPC eine flexible Plattform-Technologie für eineTigen-spezifischen T-Zell-Depletion. Ihre &quot;lego-like&quot; Natur ermöglicht die Aufnahme neuer Signale, wie zusätzliche Co-stimulierende oder hemmende Signale wie PD1 oder TRAIL auf verschiedenen Matrizen, die erweitern und verbessern ihre anschließende in vitro und in vivo Anwendbarkeit könnte. Hier berichten wir über die Schritt-für-Schritt-Protokoll zu KaAPC, die erste Wulst basierten Ansatz für die Eliminierung von Antigen-spezifischen T-Zellen aus T-Zellgemischen mit unterschiedlichen Spezifitäten. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. KaAPC beseitigen CTL in einer Antigen-spezifischen Weise PKH26-markierten aktivierten Fas +-Effektor-Memory-CTL und PKH67-markierten CMVpp65 spezifische CTL vom selben Spender wurden gemischt, um eine 1:. 1 gemischt und co-kultiviert mit CMVpp65 KaAPC 48 Stunden. Kontrollkulturen wurden mit entladen KaAPC oder 1 ug / ml behandelt,von löslichen Anti-Fas-mAb (Klon CH11). Minimalen Verlust von lebensfähigen Zellen wurde in unbehandelten Mischkulturen CTL (T-Mix) bestimmt. Original FACS-Daten für jeden CTL Population der T mix gezeigt. Analyse der Apoptose wurde wie zuvor von separaten Gating auf beiden T-Zellpopulationen 10 veröffentlicht. Zahlen in den linken oberen Quadranten dargestellt stellt% der Gesamtzellen. Die Figur veranschaulicht, wird von einem repräsentativen Experiment von drei unabhängigen Experimenten abgeleitet. Diese Forschung wurde ursprünglich in Blood veröffentlicht. . Schütz, C. et al Mörder künstliche Antigen-präsentierenden Zellen: eine neue Strategie, um spezifische T-Zellen zu löschen Blut.. 2008; 111, 3546-52. Copyright der American Society of Hematology. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

In den letzten zwei Jahrzehnten große Fortschritte im Verständnis der pathogenen Mechanismen von Autoimmunerkrankungen gemacht. Allerdings sind die häufigsten Behandlungen verlassen sich immer noch auf Kortikosteroide sowie Immunsuppressiva wie Purinanaloga, Alkylierungsmittel und Calcineurin-Inhibitoren 1. Die Verwendung solcher Arzneimittel hat sehr die Prognose der Patienten verbessert, aber die Behandlung nicht eine Heilung des Basis immunologischen Fehlfunktionen bereitzustellen. Außerdem Patienten anfällig für Infektionen und zur Entwicklung von Krebs. Daher das ultimative Ziel für die Behandlung von T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßung ist, gezielt nur Krankheit, die T-Zellen, während zur gleichen Zeit, so dass die restlichen Immunsystem unberührt und kompetent immunologischen Erkrankungen zu kämpfen. Verwendung Antigen-präsentierenden Zellen (APC) als eine Behandlung, um die Zellreaktionen zu unterdrücken peripheren T wurde bereits beschriebenden 1970er Jahren von mehreren Gruppen. Seitdem sind viele zellbasierte Ansätze entwickelt worden (in Schütz et al. 2 reviewed). Strategien durch FasL-exprimierenden Killer-APC als immunregulatorische Zellen zeigten vielversprechende Ergebnisse zeigt therapeutisches Potential für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßung und chronischen Infektionen. Es gibt jedoch signifikante Einschränkungen Strategien Verwendung FasL-Killer-APC, die letztlich begrenzt haben ihre klinische Anwendbarkeit; (I) Erzeugung und Isolierung von APC ist Zeit, Arbeit und kostenintensiv (ii) Patienten Zytopenie aufgrund der Immunsuppression eine begrenzte Menge und Qualität von Zellen (iii) Beschichtung oder Transduktion von APC mit Apoptose induzierende Signale wie FasL führt zu hoch variable Phänotypen und (iv)-Killer-APC zu Effektorfunktionen von T-Zellen zu reduzieren folglich ihr therapeutisches Potential zytotoxisch empfindlich. Daher ist es schwierig, eine definierte reproduzierbare-Killer-Phänotyp APC garantierenTyp, der für Antigen-spezifische Modulation der T-Zell-Antworten in vivo verwendet werden können. Aufgrund unserer bisherigen Arbeit mit FasL exprimieren Killer APC 3-5 und künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (AAPC) 6,7 wir eine Wulst-basierten Ansatz (KaAPC) Antigen-spezifische Hemmung oder Beseitigung von autoreaktiven T-Zellen in den entwickelten vitro. KaAPC aus einem HLA-A2-Ig-Dimer (Signal 1) und einem Anti-Fas-mAb (Apoptose-induzierende Signal), die kovalent an eine Oberfläche eines 4,5 um paramagnetische Latexkügelchen immobilisiert. Sie führen Antigen-spezifischen T-Zellen in einem Fas / FasL-vermittelten Weise von T-Zellkulturen von mehreren Spezifitäten in einer Antigen-spezifischen Art und Weise und unabhängig von der Aktivierung induzierten Zelltod (AICD) Weg. Dosis-abhängigen Apoptose in T-Zellen gezielt schnell bereits nach 30 min 8 induziert. KaAPC kann leicht in einer kontrollierten Art und Weise erzeugt werden Sicherstellung eines aus dem Regal phenot definiertyp und die meisten der Mängel der zellbasierten Strategien Erschöpfung zu überwinden. Folglich KaAPC anzuzeigen großes Potenzial für die Behandlung von T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßung, die Förderung auf dem Gebiet der T-Zell-spezifische Behandlungsstrategien.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

Strom Behandlung von T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen beruht hauptsächlich auf Strategien der globalen Immunsuppression, die auf lange Sicht ist von nachteiligen Nebenwirkungen begleitet, wie einer reduzierten Fähigkeit, Infektionen oder malignen Erkrankungen zu steuern. Daher müssen neue Ansätze entwickelt werden, die nur die Krankheit zu vermitteln Zielzellen und lassen die restlichen Immunsystem intakt ist. Im letzten Jahrzehnt eine Vielzahl von zellbasierten Immuntherapie Strategien moduliert T-Zell-vermittelten Immunantworten sind entwickelt worden. Die meisten dieser Ansätze beruhen auf Toleranz induzierende Antigen-präsentierenden Zellen (APC). Jedoch, zusätzlich zu technisch schwierig und mühsam, eine solche zellbasierte Ansätze sind sehr empfindlich gegenüber zytotoxischen T-Zell-Antworten, die ihre therapeutische Kapazität begrenzt. Hier stellen wir ein Protokoll für die Erzeugung von nicht-zellulären Killer künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC), die für den Abbau von pathologischen T-Zellen ermöglicht, während die WiederRest Immunsystem unberührt und funktional. KaAPC ist eine alternative Lösung, um zelluläre Immuntherapie, Potenzial zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßungen durch Regulierung unerwünschten T-Zell-Antworten in einem Antigen-spezifischen Weise aufweist.

Die Merkmale dieses Protokolls auf den definierten Erzeugung eines KaAPC Phänotyp, HLA-A2-Ig (Signal 1) und Anti-Fas-mAb (Apoptose-Signal) in der gleichen Zeit, die im Vergleich zu den zellbasierten Ansätze nicht durch Beschichtung verändert zeigt oder Transduktion Wirkungsgrade und kann problemlos während der Produktion (Abbildung 1) moduliert werden. Weiterhin KaAPC, sind nicht empfindlich gegenüber zytotoxischen Effektor-Funktionen von T-Zellen und ihre Funktionalität ist nicht abhängig von der Qualität der autologen Antigen-präsentierenden Zellen vor und nach In-vitro-Manipulation. KaAPC fähig sind abbau Antigen-spezifischen T-Zellen in vitro, wenn sie mit verwandten Peptid beladen, während nicht-verwandten geladen KaAPC nicht erschöpfen T-Zellen (Figur 2). Daher KaAPC induzieren T-Zell-Apoptose in einer Antigen-spezifischen Weise. Anschließend aus einem Gemisch von verschiedenen T-Zell-SPE verwendeten wir KaAPC für die selektive Abreicherung von Antigen-spezifischen T-Zellencificities, was zeigt, dass nur eine geringe Zytotoxizität wurde in Nachbar-Zellen undicht (Abbildung 3). Somit KaAPC stellen eine vorzügliche Werkzeug für In-vitro-Antigen-spezifische Depletion von humanem aktiviertem Antigen-spezifischen T-Zellen mit möglichen klinischen Anwendbarkeit bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßungen.

Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Richtlinien für die Erzeugung von Killer künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert, KaAPC, ein leistungsfähiges Werkzeug für In-vitro-Abbau von humanen Antigen-spezifische T-Zellen und eine alternative Lösung, um zelluläre Immuntherapie für die Behandlung von T-Zell-vermittelten Autoimmunkrankheiten in einem Antigen- spezifisch, ohne die restlichen Immunsystem.

Killer Künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC) für effiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Depletion von humanen Antigen-spezifischen T-Zellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

killer-artificial-antigen-presenting-cells-kaapc-for-efficient-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

9.6K Aufrufe.  Johns Hopkins University.  Richtlinien für die Erzeugung von Killer künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert, KaAPC, ein leistungsfähiges Werkzeug für In-vitro-Abbau von humanen Antigen-spezifische T-Zellen und eine alternative Lösung, um zelluläre Immuntherapie für die Behandlung von T-Zell-vermittelten Autoimmunkrankheiten in einem Antigen- spezifisch, ohne die restlichen Immunsystem. 

Serie: Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

Antigen-spezifische In Vivo Killing-Assay mit CFSE markierten Zielzellen

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Forschung

Immunologie und Infektion

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-Ig Basierend Artificial Antigen-präsentierende Zellen für eine effiziente Ex vivo Erweiterung des menschlichen CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Künstliche Antigen-präsentierenden Zelle (AAPC) vermittelte Aktivierung und Expansion der Natural Killer-T-Zellen

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Entwicklung einer Präsentation von Antigenen zu studieren Antigen-driven ulcerosa Modell durch Antigen-präsentierende Zellen zu T-Zellen präsentieren

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generieren<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

Quantifizierung von proliferierenden humanen Antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidylester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

Hocheffiziente Generierung von Antigen-spezifischen primären Maus-Zytotoxischen T-Zellen für Funktionstests in einem Autoimmun-Diabetes-Modell

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...