Bereiten Sie zunächst den Waschpuffer vor, indem Sie Hank's Balanced Salt Solution mit 10 Millimolar Heaps Puffer ergänzen. Lagern Sie den Puffer bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Retinales Pigmentepithel oder RPE-Medium in DMEM vorbereiten und im Wasserbad auf 37 Grad Celsius vorwärmen.
Legen Sie die euthanasierte Maus flach auf die Seite, mit dem Auge nach oben. Lege den Zeigefinger über das Auge und den Daumen darunter. Üben Sie sanften Druck auf die Knochenstruktur um das Auge aus, damit der Augapfel hervorsteht.
Führen Sie die Spitze einer leicht geöffneten Schere unter das Auge ein und drehen Sie das Handgelenk vorsichtig um 90 Grad vom Auge weg, bis sich das Auge von der Augenhöhle löst. Legen Sie das Auge sofort in 70%iges Ethanol und rollen Sie es fünf Sekunden lang. Übertragen Sie dann das Auge in einen auf Eis gelagerten Waschpuffer.
Legen Sie das Auge unter ein Präpariermikroskop in eine Petrischale, die mit Waschpuffer und Streifen getränkter Gaze gefüllt ist. Stabilisieren Sie das Auge, indem Sie den Sehnerv mit einer Pinzette festhalten und mit einem chirurgischen Messer vorsichtig einen Schnitt auf Höhe der Ora Serrata vornehmen. Führen Sie eine Vannas-Schere in den Schnitt ein und schneiden Sie um den Umfang der Ora Serrata herum, bis der vordere Augenabschnitt und der Glaskörper entfernt sind.
Ziehen Sie die Netzhaut mit einer angebundenen Pinzette vorsichtig von der Augenmuschel ab, ohne die RPE-Schicht zu stören. Entfernen Sie mit Hilfe einer Schere den Sehnerv und überschüssiges Bindegewebe von der Augenmuschel, ohne die Augenmuschel zu punktieren. Übertragen Sie die Augenmuschel in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das einen Milliliter 0,25 % Trypsin und 0,02 % EDTA enthält.
Inkubieren Sie die Augenmuschel 10 Minuten lang in einem 37 Grad heißen Wasserbad. Entfernen Sie alle zwei Minuten die Röhre und klopfen Sie mit der Unterseite 40 Mal fest auf die Arbeitsplatte. Mischen Sie nach der Inkubation mit der AP-1000 Pipette vorsichtig dreimal auf und ab, um die Augenmuschel zu stören.
Um das Trypsin zu neutralisieren, schichten Sie die abgelösten RPE-Blätter sofort ohne Augenmuschel auf 0,5 Milliliter FBS in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie dann tropfenweise RPE-Medien auf die Schichten der FBS- und RPE-Blätter, um das Trypsin zu verdünnen. Zentrifugieren Sie das RPE drei Minuten lang bei 340 g.
Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einer geeigneten Menge RPE-Medium für eine 24-Well-Platte. Inkubieren Sie das RPE drei Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. 24 Stunden nach der RPE-Isolierung beginnen sich kernförmige pigmentierte Zellen ohne vollständige Adhärenz anzusiedeln.
Über die 48 bis 72 Stunden heften sich diese Zellen an und breiten sich aus, wobei die dunkle Pigmentierung in einem transparenten Zellkern erhalten bleibt. Nach fünf Tagen zeigen RPE-Zellen eine erhöhte Kofluidität bei der Bildung von Zell-zu-Zell-Kontakten, die sich zu einer polarisierten Monoschicht mit hexagonalen Strukturen formen. Isoliertes RPE zeigte Reinheit, was durch den RPE-spezifischen Marker und die Integrität der Tight Junction nach sechs Tagen in Kultur belegt wurde.
