Platzieren Sie zunächst die anästhesierte Maus auf einem stereotaktischen Gerät. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen kontinuierlichen Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut und schneiden Sie einen Teil der Kopfhaut ab, um die Schädeloberfläche freizulegen. Führen Sie die Kraniotomie mit dem Mikrobohrer in der angegebenen Region durch und setzen Sie vier Punkte als Grenze.
Hören Sie auf zu bohren, wenn Hirngewebe sichtbar wird. Verwenden Sie das Bedienfeld, um den Injektor so einzustellen, dass 80 Nanoliter des Virus injiziert werden. Klicken Sie auf der Systemsteuerung auf die Schaltfläche Injizieren, um das Virus mit einer Flussrate von 1 Nanoliter pro Sekunde in den Gyrus dentatus zu injizieren.
Um das Hirngewebe zu saugen, drehen Sie die Spitze der stumpfen Nadel dicht über dem Hirngewebe und drücken Sie leicht, um die Aspiration zu erleichtern. Spülen Sie während des Absaugens kontinuierlich mit kalter Kochsalzlösung, um eine klare Sicht auf das Gehirn zu erhalten. Beobachten Sie die Gewebemerkmale genau, um die Aspirationstiefe zu überwachen.
Das kortikale Gewebe ist blassrosa. Das Corpus callosum darunter erscheint als weißes fibröses Gewebe. Und die CA1-Schicht des Hippocampus ist dunkelrot und grau.
Stoppen Sie die Absaugung, wenn die Oberfläche des Gewebes glatt wird und eine große Fläche von CA1 freigelegt wird. Schieben Sie die an der Grinslinse befestigte Halterung über das Bohrloch. Wenn die Grinslinse die Oberfläche des Hirngewebes berührt, setzen Sie die Z-Achse auf Null.
Setze die Grinslinse in das Loch an der dorsalen Bauchachse minus 1,32 Millimeter ein. Lassen Sie den Halter 5 bis 10 Minuten stehen. Heben Sie dann den Halter an und spülen Sie das Loch mit Kochsalzlösung aus.
Tragen Sie mit einer Nadel das ultraviolette Harz um die Grinslinse auf. Beleuchten Sie den Bereich 15 Sekunden lang mit ultraviolettem Licht, um sicherzustellen, dass das Harz fest wird. Entferne die Halterung vorsichtig von der Grinsscheibe.
Bedecken Sie den gesamten freiliegenden Schädel mit ultraviolettem Harz. Platzieren Sie die Kopfplatte in der entsprechenden Position auf dem Schädel. Beleuchten Sie den gesamten Schädel und die Kopfplatte 15 Sekunden lang mit ultraviolettem Licht.
Decken Sie die freiliegende Grinslinse mit einer 3D-gedruckten Schutzkappe ab. Befestigen Sie die Kappe mit M1.6-Schrauben an der Kopfplatte. Schalten Sie die Miniscope-Steuerungssoftware ein und klicken Sie auf Konfigurationsdatei auswählen.
Wählen Sie dann vscode und dann Benutzerkonfigurationsdateien aus. Klicken Sie nun auf Ausführen. Schieben Sie dann den LED-Netzschalter, um die Helligkeit einzustellen.
Schieben Sie die Fokuseinstellungstaste, um den Wert nahe Null zu setzen. Befestigen Sie die Grundplatte am Mini-Zielfernrohr und stellen Sie die Position des Mini-Zielfernrohrs neu ein, um ein Sichtfeld mit guter Bildqualität zu erhalten. Tragen Sie die erste Schicht des Prothesengrundmaterials vorsichtig um die Mini-Zielfernrohr-Basisplatte auf.
Sobald die erste Schicht des Zements ausgehärtet ist, tragen Sie eine zweite Schicht Zement von der Grundplatte auf die Kopfplatte auf. Nachdem das gesamte Prothesengrundmaterial ausgehärtet ist, lösen Sie die Stellschraube und lösen Sie das Mini-Scope von der Basisplatte. Setzen Sie die Kappe der Grundplatte in die Grundplatte ein, um die freiliegende Grinslinse zu schützen, und ziehen Sie die Stellschraube fest.
Konvertieren Sie nach dem Imaging die Imaging-Daten vom AVI-Format in das HDF5-Format. Wenden Sie die nicht starre Bewegungskorrektur an und führen Sie ein Downsampling des bewegungskorrigierten Films durch. Wenden Sie Extrakt auf die Downsample-Daten an, um Einzelzellsignale zu identifizieren.
Wenden Sie dann die Zellenprüfung an und wählen Sie die potenziellen Zellen manuell aus. Klicken Sie auf Daten speichern, bevor Sie das Fenster zur Zellenprüfung schließen. Speichern Sie abschließend die Datendateien.
In erfolgloser in vivo Calcium-Bildgebung wurden keine aktiven Zellen im bildgebenden Sichtfeld beobachtet. Erfolgreiche In-vivo-Calcium-Bildgebung zeigte weniger als 10 aktive Zellen ohne offensichtliche Blutgefäße. Mehr als 50 aktive Zellen mit sichtbaren Blutgefäßen.
Und Hunderte von aktiven Zellen mit klaren Blutgefäßen. Extrahierte Einzelzellen aus einer erfolgreichen in vivo Calcium-Imaging-Aufnahme wurden mit repräsentativen Calciumspuren in das Sichtfeld eingeblendet. Die Position der GCaMP6F-Expression und die Spur der Grinslinse wurden im Schnitt des Maushirns verifiziert.
