Diese Methode kann helfen, schlüsselwichtige Fragen in der Neurowissenschaft zu beantworten, vor allem diejenigen im Zusammenhang mit Neuron Encke-Bildung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Forscher die morphologischen Veränderungen einzelner Neuronen bei lebenden neonatalen Mäusen analysieren können. Beginnen Sie mit einem anästhesierten postnatalen Tag fünf Welpen und gehen Sie nur in Ermangelung einer Reaktion auf den Schwanz Pinch Test.
Zuerst sterilisieren Sie die Kopfhaut, indem Sie sie mit 70% Ethanol abwischen. Verwenden Sie dann eine mit 70% Ethanol sterilisierte Schere, um etwa 20 Quadratmillimeter der Schädeldecke zu entfernen. Als nächstes verwenden Sie sterile Zangen und einen sauberen Wattestäbchen in Kortexpuffer getränkt, um die Faszien des Schädels zu entfernen.
Verwenden Sie eine Ladespitze, um Gewebekleber auf die eingeschnittene Hautoberfläche aufzutragen, um die Blutung zu stoppen und gleichzeitig den zu bebildernden Bereich zu vermeiden. Legen Sie den Welpen auf ein anderes Heizkissen, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, und lassen Sie ihn von der Anästhesie erholen. Warten Sie ca. 30 Minuten, bis der Gewebekleber getrocknet und verfestigt ist.
Sobald der Gewebekleber getrocknet ist, beginnen Sie mit der Kranfenstervorbereitung an der neu anästhesierten Maus. Tragen Sie einen Tropfen Kortexpuffer auf den Schädel auf, und verwenden Sie dann eine sterile Rasierklinge, um vorsichtig einen Bereich mit einem Durchmesser von einem Millimeter des Schädels zu öffnen, so dass die Dura intakt bleibt. Tragen Sie den Kortexpuffer auf, um die Gehirnoberfläche feucht zu halten.
Verwenden Sie ein kleines Stück Gelatineschwamm in Kortexpuffer getränkt, um jede Blutung zu stoppen. Verwenden Sie ein frisches Stück, um eine Seite der Kraniotomie zu komprimieren und entleeren Sie jeden Puffer und Blut von der Duraloberfläche, ohne die Dura zu berühren. Dies ist der wichtigste Schritt, um ein klares Fenster vorzubereiten.
Die Dura muss unbeschädigt sein und die Bürste sollte von der freiliegenden Dura entfernt werden. Als Nächstes verwenden Sie eine Pipettenspitze, um eine dünne Schicht von einem Prozent niedriger Schmelzagarose aufzutragen, die im Kortexpuffer gelöst ist. Tragen Sie einen runden, drei Millimeter langen Glasdeckel auf die Agarose-Gelschicht auf.
Entfernen Sie alle Blasen zwischen dem Deckelschlupf und der Agarose-Gelschicht, indem Sie mehr als Agarose-Gel zwischen sie gießen. Verwenden Sie eine Pinzette, um das überschüssige Gel zu entfernen, das unter dem Deckschein hervorragt. Mischen Sie Zementpulver und die Zementflüssigkeit.
Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um die Mischung auf den Schädel aufzutragen, bevor sie verfestigt wird. Dann befestigen Sie eine maßgeschneiderte Titanstange mit Zahnzement am Schädelknochen. Richten Sie den Titanbalken aus, und der Deckelschlupf parallel, um Bilder einfach zu erfassen.
Bedecken Sie den freiliegenden Schädel mit Zahnzement. Dann, subkutan injizieren ein Schmerzmittel. Legen Sie den Welpen in einem Erholungskäfig auf einem 37 Grad Celsius Heizkissen für eine Stunde, bis der Zahnzement erstarrt ist.
Um mit der Bildgebung zu beginnen, legen Sie zunächst die Wellenlänge des Zweiphotonenlasers fest. Verwenden Sie für die RFP-Erregung eine Wellenlänge von 1000 Nanometern. Wischen Sie die Oberfläche des Deckelschlupfes mit 70% Ethanol ab.
Befestigen Sie den anästhesierten Welpen mit der Titanstange an der Titanplatte auf der Bildstufe. Verwenden Sie die Goniometer-Stufe, um den Kopf so einzustellen, dass der Deckschein parallel zur Objektivlinse ist. Halten Sie die Körpertemperatur des Welpen während der Bildgebung mit einem Auf 37 Grad Celsius eingestellten Heizpad aufrecht und reduzieren Sie die Isoflurankonzentration auf 0,7% bis 1%Stellen Sie die Bildstufe unter die 20-fache Objektivlinse der beiden Photonenmikroskop.
Tragen Sie einen Tropfen Wasser auf den Deckelzettel auf. Stellen Sie die Software so ein, dass Z-Stack-Bilder in 1,4-Mikron-Intervallen erfasst werden. Für Die Neuronenbildgebung der Schicht 4 stellen Sie die Z-Breite auf 150 bis 300 Mikrometer fest, um die gesamte dendritische Morphologie abzubilden.
Verwenden Sie langsames Scannen und Mittelung, um klare Bilder zu erhalten, die die neuronale Morphologie zeigen. Es dauert in der Regel mehr als 20 Minuten, um die gesamte dendritische Morphologie zu erwerben. Dieses Bild zeigt ein repräsentatives Z-Stack-Bild der Schicht vier kortikale Neuronen von P5 Welpen.
Der Pfeil zeigt das zu analysierende Neuron an. Neuronen mit verschwommenen Dendriten sollten aus der Analyse entfernt werden. Dieses Bild zeigt ein höheres Vergrößerungsbild des angezeigten Neurons im vorherigen Bild.
Blaue Pfeilspitzen zeigen dendritische Spitzen an, die beim nächsten Zeitpunkt zurückgezogen werden, und die kleinen weißen Pfeilspitzen zeigen das Axon einer benachbarten Zelle an. Nach 4,5 Stunden werden die dendritischen Spitzen mit blauen Pfeilspitzen zurückgezogen und die dendritischen Spitzen mit gelben Pfeilspitzen gestreckt. Hier wird eine repräsentative dendritische Morphologierekonstruktion gezeigt, Neuronen, die getrennte Dendriten zeigen, wie hier zu sehen, sollten von den Analysen ausgeschlossen werden.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Dura während des Prozesses intakt zu halten. Mit diesem Verfahren können andere Methoden wie in der Antriebsbildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit dem Neuronenaktivitätsmuster im neonatalen Gehirn zu beantworten.
