Diese Methode kann helfen, grundlegende Fragen im Bereich des Hörens und der Ausgewogenheit zu beantworten. Es beschreibt, wie man zwei wichtige Aspekte der sensorischen Haarzellen Funktion zu erkennen, mechanotransduktion und präsynaptische Aktivität. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie es uns ermöglicht, die Funktion von Haarzellen in einem lebenden Tier zu visualisieren und zu untersuchen, wie Sammlungen von Haarzellen sensorische Informationen erkennen und übertragen.
Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie feine Zangen und Wolframdraht, um die Stifte zu gestalten, um die Larve durch den Kopf und Schwanz zu immobilisieren, auf dem gehärteten Verkapselung. Um Kopfstifte zu machen, halten Sie ein Stück 0,035 Millimeter Wolframdraht in einer Hand. Mit feinen Zangen in der anderen Hand, biegen Sie den Draht einen Millimeter vom Ende, bei 90 Grad.
Tauschen Sie die Zange gegen eine feine Schere aus, und schneiden Sie einen Millimeter nach der Biegung, um den Stift zu erstellen. Verwenden Sie dann Zangen, um die Stifte in die gehärtete Kapselung auf der Kammer einzufügen. Positionieren Sie die Larve in der Mitte der Perfusionskammer so, dass sie seitlich gegenüber dem Silikonverkapselungsmittel flach liegt.
Mit feinen Zangen, bringen Sie die 0,035 Millimeter Kopf pin senkrecht zur Larve. Setzen Sie den Kopfstift zwischen das Auge und das otische Vesikel und nach unten in das Verkapselungsmittel. Verwenden Sie einen zweiten Satz Zangen, um die Larve entlang ihrer dorsalen und ventralen Seite zu stabilisieren, während Sie anheften.
Stellen Sie sicher, dass der horizontale Teil des Stifts die Larve kontaktiert und nicht ganz in das Verkapselungsmittel drückt. Winkeln Sie den Stift ventral oder leicht in Richtung des vorderen Derva, um zu vermeiden, dass die nachfolgende Herzinjektion und Haarzellenbildgebung stören. Mit den Zangen einen 0,025 Millimeter langen Schwanzstift in den Notochord einstecken, so nah wie möglich am Ende des Schwanzes.
Um Alpha-Bungarotoxin in die Larve zu injizieren, füllen Sie drei Mikroliter der Lösung in die Injektionsnadel, indem Sie eine Gel-Ladepipettenspitze verwenden. Laden Sie die Lösung gleichmäßig auf die Spitze, ohne Blasen. Dann setzen Sie die Herzinjektionsnadel in einen Pipettenhalter, der an einem manuellen Mikromanipulator befestigt ist.
Positionieren Sie die Nadel unter einem Stereomikroskop so, dass sie senkrecht zur AP-Achse der anästhesierten Larve ausgerichtet ist und in einem Winkel von 30 Grad nach unten zeigt. Schließen Sie als Nächstes den Pipettenhalter an den Druckinjektor an. Injizieren Sie einen Bolus alpha Bungarotoxin in die Lösung, um zu testen, ob die Nadelspitze klar ist.
Wenn keine rote Farbe zu sehen ist, kratzen Sie sehr sanft die Nadelspitze gegen den Rand eines Stifts, und versuchen Sie es erneut, bis die Nadel klar ist. Anschließend, bewegen Sie die Nadel in Richtung des Herzens, bis es die Haut außerhalb des Herzens berührt. Drücken Sie die Nadel in die Larve, und suchen Sie nach Einbuchtung der Pigmentzelle auf der Haut vor dem Herzen, um sicherzustellen, dass die Nadel in der richtigen Ebene positioniert ist, relativ zur Larve.
Dann rücken Sie die Nadel weiter voran, bis sie die Haut durchbohrt und in die Herzhöhle gelangt. Ziehen Sie die Nadel leicht zurück und injizieren Sie einen Bolus alpha Bungarotoxin in die Herzhöhle. Achten Sie auf die Inflation der Herzhöhle oder auf roten Farbstoff, der in die Höhle eintritt.
Spülen Sie die Larve dreimal vorsichtig ab, mit einem Milliliter neuronalen Puffer, um den Rest MS222 zu entfernen. Entfernen Sie niemals die gesamte Flüssigkeit. Larven in ca. 1 Millileter neuronalen Puffer in der Perfusionskammer aufbewahren.
In diesem Verfahren vertueren Sie 10 Mikroliter Neronalpuffer in eine ordnungsgemäß gebrochene Fluid-Jet-Nadel mit einer Gel-Ladespitze. Laden Sie die Lösung gleichmäßig auf die Spitze ohne Blasen. Stecken Sie dann die Nadel in den Pipettenhalter, der am motorisierten Mikromanipulator befestigt ist.
Legen Sie die Perfusionskammer in einen kreisförmigen Kammeradapter auf der Mikroskopstufe. Bewegen Sie die motorisierte Stufe so, dass sich die Larve in der Mitte des Sichtfeldes befindet. Anschließend drehen Sie den kreisförmigen Kammeradapter so, dass der AP-Zugang zur Larve grob an der Flugbahn der Fluid-Jet-Nadel ausgerichtet ist.
Mit Durchlicht und Differentialinterferenzkontrast, bringen Sie die Larve in den Fokus und zentrieren Sie sie unter dem 10-fachen Objektiv. Heben Sie dann das 10-fache Ziel an. Mit dem motorisierten Mikromanipulator bringen Sie die Fluid-Jet-Nadel in die Mitte des Sichtfeldes, so dass sie durch das übertragene Licht beleuchtet wird und den neuronalen Puffer kaum berührt.
Senken Sie das 10x Ziel, sich auf die Larve zu konzentrieren, um ihre Lage zu bestätigen. Das Ziel auf der Fluid-Jet-Nadel. Bewegen Sie die Fluid-Jet-Nadel mit dem Mikromanipulator in der x- und y-Achse, bis sie sich in einer Position parallel zur dorsalen Seite der Larve befindet.
Danach konzentrieren Sie sich wieder auf die Larve. Bringen Sie die Nadel in der Z-Achse nach unten und positionieren Sie die Nadel entlang der Rückenseite des Fisches, 1 Millimeter vom Körper entfernt. Bewegen Sie den kreisförmigen Kammeradapter vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Fluidstrahlnadel entlang der AP-Mittellinie der Larve ausgerichtet ist.
Wechseln Sie als Nächstes zum 60x Wasserobjektiv. Stellen Sie sicher, dass das Ziel im neuronalen Puffer emersiert wird. Verwenden Sie den feinen Fokus, um einen Neuromast zu lokalisieren.
Anschließend bewegen Sie die motarisierte Bühne, um den Neuromast von Interesse in der Mitte des Sichtfeldes zu platzieren. Halten Sie die Flüssigkeitsstrahlnadelspitze entlang der rückenden Seite des Fisches. Berühren Sie die Fluid-Jet-Nadelspitze nicht an der Larve oder der Kammeroberfläche.
Positionieren Sie die Fluid-Jet-Nadel mit dem Mikromanipulator so, dass sie 100 Mikrometer vom äußeren Rand des Neuromastes entfernt ist. Konzentrieren Sie sich dann auf die Spitzen der apikalen Haarbündel. Der Boden der Fluid-Jet-Nadel sollte in dieser Ebene im Fokus stehen.
Stellen Sie die Hochgeschwindigkeits-Druckklemme vom manuellen in den externen Modus ein, um ein Eingaben von der Bildverarbeitungssoftware zu erhalten. Null die Hochgeschwindigkeits-Druckklemme durch Drücken der Nulltaste, und verwenden Sie den Sollwertknopf, um den Ruhedruck leicht positiv einzustellen. Bestätigen Sie den Ruheausgang der Hochgeschwindigkeits-Druckklemme mit einem PSI-Manometer, das an der Kopfstufenausgabe befestigt ist.
Um den Druck zu bestimmen, der erforderlich ist, um die Haarbündel zu stimulieren, wenden Sie einen Testreiz mit einem 0,125 und 0,25 Volt Ausgang für 200-500 Millisekunden an. Für jeden Testreiz messen Sie den Abstand der Durchbiegung der Spitzen der Haarbündel, der Kinocilia. Wählen Sie einen Druck, der die Bündel in einem Abstand von etwa 5 Mikrometern bewegt.
Stellen Sie sicher, dass die Tipps der Kinocilia die ganze Zeit im Fokus bleiben. Um Einzelebenenbilder zu erfassen, wählen Sie einen Stimulus aus, der während der 80-Frame-Erfassung nach Frame 30 in 3 Sekunden geliefert werden soll. Um mechanosensitive Kalziumreaktionen zu messen, konzentrieren Sie sich auf die Basis der apikalen Haarbündel und starten Sie die Bildaufnahme.
Um präsynaptische Kalziumreaktionen zu messen, konzentrieren Sie sich auf die Basis der Haarzellen und starten Sie die Bildaufnahme. Die Schritte zur Visualisierung der räumlich-zeitlichen Veränderungen der GCaMP6S-Intensität innerhalb eines Neuromasts während der Simulation werden hier beschrieben. Die Zeit wird von links nach rechts entsprechend dem Zeitstempel dargestellt.
Die obere Zeile zeigt fünf der vierzehn zeitlichen Abschnitte aus einer 70-Frame-GCaMP6S F-Bildsequenz. In der zweiten Zeile wurde die Baseline aus jedem GCaMP6S F-Binned-Bild entfernt, um Delta-F-Bilder zu erstellen. In der dritten Zeile wurden Delta-F-Bilder von Graustufen in eine rote Hot-Lookup-Tabelle konvertiert.
In der unteren Zeile wurde die dritte Zeile auf die F-Bilder in der oberen Zeile überlagert. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, sicherzustellen, dass die Larve korrekt angeheftet ist, und geeignete Kontrollen zu verwenden, wie im Manuskript beschrieben, um Bewegungsartefakte aus Ihren Daten auszuschließen. Die Arbeit mit Alpha-Bungarotoxin kann gefährlich sein.
Es ist wichtig, Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, wie das Tragen von Handschuhen während der Handhabung.
