Bereiten Sie zunächst Wachsblöcke von euthanasierten Mäusen vor, die mit Xiaoyao-Pillen injiziert wurden. Schneiden Sie die Wachsblöcke in sechs Mikrometer dicke, durchgehende Abschnitte und backen Sie die Scheiben bei 70 bis 72 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten. Übertragen Sie die Scheiben für acht Minuten in die Entparaffinierungslösung, dehydrieren Sie sie dann zweimal für jeweils fünf Minuten in 75 % wasserfreiem Ethanol, bevor Sie sie fünf Minuten lang in PBS spülen.
Führen Sie nun 15 Minuten lang eine EDTA-Hochdruckreparatur durch. Nach dem Spülen mit PBS 3% Wasserstoffperoxid tropfenweise in das Gewebe geben und 10 Minuten inkubieren. Waschen Sie das Taschentuch dreimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS.
Zeichnen Sie mit einem immunhistochemischen Stift einen Kreis um das Gewebe. Nach dem Waschen des Gewebes mit PBS über Nacht in der Primärantikörperlösung färben. Spülen Sie das Taschentuch am nächsten Tag dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS.
Geben Sie tropfenweise den sekundären Antikörper hinzu und inkubieren Sie ihn 60 Minuten lang. Nach dem Spülen mit PBS das Tuch drei bis fünf Minuten lang in gebrauchsfertiger DAB-Lösung inkubieren. Färben Sie nun das Gewebe drei Minuten lang mit Hämatoxylin.
Spülen Sie das Gewebe erneut mit PBS aus, bevor Sie es 10 Sekunden lang in eine Differenzierungslösung legen. Nach dem PBS-Spülen die Rücklauflösung 10 Sekunden lang hinzufügen. Führen Sie abschließend fünf Minuten lang eine Behandlung mit 75 % wasserfreiem Ethanol durch und versiegeln Sie den Objektträger mit neutralem Harz.
Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung zeigte bei Scheinmäusen eng angeordnete Trabekel, während OVX-Mäuse typische osteoporotische Veränderungen mit spärlichen Trabekeln und vergrößerten Knochenmarkhöhlen zeigten. Der Mikro-CT-Vergleich zeigte ein unvollständiges Trabekelwerk und eine Ausdünnung der Knochenrinde bei OVX-Mäusen im Vergleich zu Scheinmäusen. Nach medikamentöser Intervention zeigte die Hämatoxylin-Eosin-Färbung im Vergleich zur OVX-Gruppe eine wiederhergestellte Trabekelstruktur und eine reduzierte Knochenmarkhöhle.
Die bildgebenden Indizes zeigten weniger frakturierte Trabekel und eine wiederhergestellte Retikulation in der hochdosierten Xiaoyao-Pillengruppe im Vergleich zur OVX-Gruppe. Die immunhistochemischen Ergebnisse zeigten eine erhöhte alkalische Phosphatase und Kollagen Typ 1 und eine Abnahme von Interleukin 17, ACT1 und Interleukin 6 in der Wirkstoffgruppe.
