Wir danken Michael J. Bruno, Radda Rusinova und Jon T. Sack für viele anregende Diskussionen. Finanzielle Unterstützung von NIH, R01GM021342 und ARRA ergänzen R01GM021342-35S1 und die Josiah Macy, Jr. Foundation OSA, die Tri-I CMB-Programm für HII, und die Iris L. und Leverett S. Woodworth Medical Scientist Fellowship und NIH MSTP gewähren GM07739 für RK.

1. Generieren Sie ANTS gefüllte Liposomen <ol><li> Am Tag 1, entfernen organische Lösungsmittel aus Lipiden. </li><li> Entfernen Lipid aus dem Gefrierschrank und lassen Sie es auf Raumtemperatur äquilibriert. </li><li> Fügen Sie 0,6 ml 25 mg / mL (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholin) Lipid in Chloroform-Lösung in einen 25 mL Rundkolben. </li><li> Ständig drehen der Flasche während der Trocknung unter Stickstoff, bis alle das Chloroform verdampft ist und eine dünne weiße Lipidfilm bedeckt die gesamte untere Hälfte der Flasche. </li><li> Dry in einem Exsikkator unter Vakuum über Nacht. </li></ol><ol><li> Am Tag 2 Vorbereitung der Probe mit dem Fluorophor, der in die Vesikel aufgenommen werden. </li><li> Rehydrieren in 100 mM NaNO 3, 25 mM ANTS (Na-Salz), 10 mM HEPES. Verwenden HNO 3 oder NaOH auf pH auf 7,0 einzustellen. Jedes Molekül hat ANTS 2 Na +, für eine Gesamtmenge von 150 mM [Na +]. Add 1,671 mL des Elektrolyten zu einer 10 mM Lipidsuspension bekommen. </li><li> Parafilm und Vortex-Fahrwerk gründlich. </li><li> Schützen Probe von Licht mit einer Folie und lassen Sie es Alter über Nacht bei Raumtemperatur. </li></ol><ol><li> Am Tag 3, machen große unilamellare Vesikel und entfernen Sie alle Fluorophor von außerhalb der Vesikel. </li><li> Ultraschallbad für 1 min in einem Low-Power-Ultraschallgerät. </li><li> Frost-Tau-Probe 5-6 Mal, jedes Mal mit 5 Minuten auf Trockeneis und 5 Minuten in warmem (~ 50 ° C) Wasser. </li><li> Extrude die Lipidsuspension mit einem Avanti Mini-Extruder. Richten Sie die Mini-Extruder mit einer 0,1 um Polycarbonat-Filter und Filter unterstützt (siehe Extruder Handbuch für Details). Extrude die Aussetzung hin und her 21 mal so, dass die Aussetzung endet auf der gegenüberliegenden Spritze. Wenn mehrere Chargen extrudiert werden, immer daran denken, Proben mit einer Spritze zu laden. Während der Extrusion die trübe ersten Lipidsuspension werden sollte fast durchsichtig (es wird immer noch gelb wegen der ANTS Fluorophor). Wenn der Extrusion wird plötzlich leichter und weniger Druck benötigt wird, um durch den Filter zu verschieben, kann der Filter gerissen und muss ersetzt werden. </li><li> Entfernen Sie den äußeren ANTS, indem Sie das extrudierte Suspension über eine PD-10 Entsalzungssäule mit einem Schwerpunkt-Protokoll. Äquilibrieren Säule mit 20-30 ml Na-Puffer (140 mM NaNO 3, 10 mM HEPES, pH 7,0, denken Sie daran, HNO 3 oder NaOH zu verwenden, um pH-Einstellung). Fügen Sie 1,5 ml der extrudierten Lipidsuspension, um die Spalte und lassen Sie es sickern in. Bringt das Gesamtvolumen der Probe auf 2,5 ml durch Zugabe von 1 mL Na-Puffer. Nachdem der Puffer ist voll in die Spalte eingearbeitet und es wird nichts ausläuft, eluieren die Liposomen mit 3 ml Na-Puffer und sammeln Sie die erhaltene Probe. Die daraus resultierende ANTS gefüllt LUV Stammlösung sollte etwa 4-5 mm Lipide enthalten und erscheinen transparent milchig weiß. Schützen Sie die Probe aus Licht, mit einer Folie. </li><li> Wenn die Aktie Lösung nicht sofort verwendet wird, lagern bei 13 ° C für maximal 7 Tage. Achtung: nicht einfrieren oder kühlen die Lipid-Lösung unter dem Flüssigkeit-Kristall-Phasenübergangstemperatur (~ 12 ° C), da dies die Vesikel &quot;Integrität zu zerstören und das Fluorophor wird auslaufen. </li></ol> 2. Mix Fluoreszenz-Lösung <ol><li> 24 Stunden vor dem Gebrauch zu verdünnen Liposomen und inkubieren mit Gramicidin (bei 13 ° C). Equilibrierung Gramicidin zwischen den Lipid-Vesikel &quot;inneren und äußeren Monoschichten ist ein langsamer Prozess, der eine lange Inkubationszeit. </li><li> Gründlich vortexen der ANTS gefüllten LUV Stammlösung als LUVs einer Dichte von&gt; 1 g / mL haben und wird daher Sediment in den Lösungen. </li><li> Mix der ANTS gefüllten LUV Lager 1:20 in Na-Puffer. Mischen Sie alle Liposomen für den Einsatz an einem Tag von Experimenten in einem einzigen Kolben auf Probe Einheitlichkeit zu verbessern. </li><li> Separate aus 3 / 4 der Liposomen und fügen 260 nm Gramicidin in DMSO vorverdünnt (500 ug / mL). </li><li> Um die restlichen 1 / 4 add das gleiche Volumen an DMSO (ohne Gramicidin) zu halten das Lösungsmittel Konzentration konstant in allen Proben. </li></ol> 3. Einrichten des Fluoreszenz-Instrument <ol><li> Wir verwenden einen Angewandte Photophysik SX.20 stopped-flow Spektrofluorometer mit Temperaturregelung, die Rate der Fluoreszenzlöschung zu messen. </li><li> Schalten Sie die Instrumente auf eine Stunde vor der Zeit, für aufwärmen können. Die Komponenten sind: Computer, elektronische Steuerung, Wasserbad (beide Kühler und Heizer), Lampe Stromversorgung und Stickstoff-Tank. </li><li> Richten Sie die Aufnahmebedingungen mit dem Pro-Data SX-Software. </li><li> Setzen Sie den Monochromator Anregungswellenlänge auf 352 nm und Spaltbreite Öffnungen für die Anregung zu 1 / 1. </li><li> Verwenden Sie ein λ = 455 nm High-Pass-Filter, um die Emission aufzunehmen. </li><li> Verwenden Sie den &quot;Druck Hold&quot;-Einstellung, die das Instrument ermöglicht es, die Stickstoff-Druck während der Aufnahme zu halten und verhindert somit Druckschwankungen (und Aufzeichnung Artefakte) während der ersten paar Millisekunden. </li><li> Set &quot;Time &quot;bis 1 s und&quot; Points &quot;bis 5000. </li><li> Verwenden Sie das wiederholen Box und stellen Sie die Anzahl der Wiederholungen, die wir normalerweise verwenden 9 und 13 Wiederholungen für Puffer-und Quencher läuft, bzw.. </li><li> Wasserbadtemperatur auf 25 ° C eingestellt werden, die Temperatur sollte in der SX-Software überwacht werden. </li><li> Legen Sie das Laufwerk Volumen bis 120 ul, was bedeutet, dass jedes Mal, wenn das Gerät eine Probe läuft, mischt er 60 &amp;mgr; l von jeder der zwei Spritzen. Mit dieser instrumentalen Setup, gibt einen 120 ul Volumen einer Totzeit von ≈ 1,2 ms. </li><li> Passen Sie die Hochspannung (Gewinn) aus dem Fluoreszenz-Detektor für die Ameisen-Liposom-Ausgang auf rund 8 sein. Für einen Standard-experimentelle Mischung der Gewinn sollte 400-420 V. Einige Medikamente sind fluoreszierend, so dass sie sich das Fluoreszenzsignal zu sättigen. In diesen Fällen sollten die Gewinn / Spannung verringert werden. </li><li> Legen Sie immer das fluoreszierende Probe in der linken Spritze und Puffer / Löscher in die richtige Spritze. Stellen Sie sicher, gründlich vortexen alle Proben mit Liposomen vor dem Laden, und sich bewusst sein, dass die LUVs mit der Zeit wird in die Spritze zu begleichen. </li></ol> 4. Ein Experiment <ol><li> Bereiten Sie eine Probe von ANTS-geladen LUVs entweder mit Lösungsmittel oder Verbindung, und laden Sie in die Spektrofluorometer entweder zusammen mit Na-Puffer oder Tl-Löscher (50 mM TlNO 3, 94 mm NaNO 3, 10 mM HEPES bei pH 7,0). </li><li> Verwenden Sie 1,5 ml verdünnt ANTS-LUV-Lösung, mit oder ohne Gramicidin, vorbereitet vom Vortag. </li><li> Fügen Sie die Verbindung in der gewünschten Konzentration oder das Lösungsmittel für die Kontrollen. Halten Sie die Lösemittelkonzentration auf ein Minimum und konstant über alle Proben. Die Konzentrationen müssen bei jedem neuen (unbekannten) Verbindung eingestellt werden, um die gewünschte Dosis-Wirkungs-Bereich zu erreichen. Inkubieren für 10 min bei 25 ° C im Dunkeln. </li><li> Vortex die LUV Probe und Last in der linken Spritze. Laden Sie die Na-Puffer oder Tl-Löscher in die richtige Spritze. </li><li> Gründlich entfernen Luftblasen aus beiden Proben, indem Sie die Spritzen hin und her. </li><li> Achten Sie darauf, beide Spritzen gleichermaßen vor dem Schließen der Ventile geladen. Ungleiche Belastung wird in der Vor-Mischen von Lösungen führen, bevor sie die Aufnahme Kammer zu erreichen. </li><li> Zum ersten Probe, Aufzeichnung der Fluoreszenz mit Na-Puffer, 4-mal wiederholen, stellen Sie die Hochspannung (Gewinn) wie nötig, und wiederholen Sie 5 mal. </li><li> Für die restlichen Proben, Record 9 wiederholt mit Na-Puffer. </li><li> Ersetzen Sie den Na-Puffer mit dem Tl-Quencher und Datensatz 13 Wiederholungen. </li><li> Mit Wasser abspülen und weiter mit der nächsten Probe. Als Kontrollen verwenden wir Proben mit: no Gramicidin und mit Lösungsmittel, keine Gramicidin und mit der maximalen Konzentration der Verbindung, sowohl mit Gramicidin und Lösungsmittel. </li></ol> 5. Analysieren von Daten <ol><li> Übertragen Sie die Ergebnisse der Analyse-Computer. Lesen Sie alle Daten in MATLAB zur Analyse. Für jede Probe in all den Puffer und Quencher wiederholt zu lesen, ohne die ersten vier in jedem Fall, wie die Vermischung Artefakte enthalten. Ausgehend von einem Laufwerk Volumen von 120 ul dauert es ein bisschen weniger als vier Schüsse ganz klar aus der vorherigen Mischung aus der Stopped-Flow-Schlauch. </li><li> Der Puffer wiederholt sich für alle Proben sollten sehr ähnlich sein. Wenn es eine deutliche Verschiebung in der Fluoreszenz-Signal, das auf der Konzentration der Verbindung hängt, dann ist die Verbindung selbst kann fluoreszierenden und kann es notwendig sein, zuerst subtrahieren diese zusätzliche Fluoreszenzsignal vor der Normalisierung der Proben. </li><li> Manuell über die Spuren zu gehen und zu entfernen &quot;schlechte&quot; wiederholt: wiederholt mit Spikes oder Abweichungen von multi-Exponentialität durch Mischen Artefakte und / oder Blasen. </li><li> Normalisieren der Quencher wiederholt, um die durchschnittliche Startwert des Puffers wiederholt sich für jede Probe. Kombinieren Mittelwerte aller Proben in einem Diagramm zur Visualisierung. </li><li> Traces ohne Gramicidin aufgezeichnet sollten alle ähnlich und zeigen fast keine Fluoreszenzlöschung, es kann eine langsame Reduktion der Fluoreszenz-Signal durch Leckage von Tl + langsam durch die Vesikel-Doppelschicht 8 sein. Wenn die Probe ohne Gramicidin und kein Modifikator zeigt deutliche Abschreckung, dann die Bläschen haben sich verschlechtert und sollte nicht weiter verwendet werden. Wenn die Proben ohne Gramicidin aber mit dem Modifikator signifikante Abschrecken zeigen, dann ist die Modifier stört die Vesikel-Doppelschicht in einem solchen Ausmaß, dass sie das Fluorophor oder Quencher der Doppelschicht Kreuz ermöglicht. </li><li> Wenn die Verbindung ändert Lipiddoppelschicht Eigenschaften, wie spürte von Gramicidin-Kanäle wird die Fluoreszenz Zeitverlauf sichtbar verändert werden. </li><li> Für jede Probe eine gestreckte Exponentialfunktion <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg1.jpg" alt="Gleichung 1" /> zB 4) ist die erste 2-100 ms der normierten Fluoreszenzlöschung Kurve der einzelnen Wiederholungen und die Rate fit <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg2.jpg" alt="Abbildung 2" /> 4berechnet auf 2 ms. Mittelwerte und Standardabweichungen sind für eine gegebene Probe von allen den einzelnen Wiederholungen berechnet. </li><li> Schließlich bestimmen die relative Änderung in Abschreckgeschwindigkeit durch die Normalisierung auf den nächsten Kontrollprobe in der Zeit, dass Gramicidin und kein Modifier hat. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Die Grundlagen der Fluoreszenz löschen-basierter Assay, um Änderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften erkennen Oben links:. Ein Zoom-in auf einem einzigen Lipidvesikel mit Ameisen und NaNO 3 auf der Innenseite und NaNO 3 plus TlNO 3 auf der Außenseite. Oben rechts: Die Fluoreszenz-Signal aufgezeichnet Verwendung (Formular oben nach unten) ANTS-Vesikel ohne Quencher, mit Löscher, mit Quencher und pre-dotiert mit 87, 260 und 780 nm Gramicidin. Unten: Schematische Darstellung der Stopped-Flow-Mischkammer. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: A-Bildschirm aus dem Pro-Data SX-Software, welche die verschiedenen Panels in der Beschreibung des Versuchsaufbaus verwiesen erschossen. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3:. Multiple wiederholen Bestimmungen des Fluoreszenzsignals von ANTS-geladen LUVs mit Na-Puffer Die ersten vier Wiederholungen sind grundsätzlich ausgeschlossen, da sie Mischen Artefakte enthalten. Der Schlauch verbindet die Probe Spritzen der Mischzelle haben ein definiertes Volumen, also die ersten paar Wiederholungen geben uns eine Lesart dessen, was vorher in den Schlauch: Wasser für Repeat 1 und 2, eine Kombination von Wasser und Probe zu wiederholen 3, meist Probe wiederholen 4, und nur Probe für die verbleibenden Wiederholungen. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4:. Multiple wiederholen Bestimmungen des Fluoreszenzsignals von ANTS-geladen LUVs mit Na-Puffer und mit Tl-Quencher Die ersten vier Wiederholungen wurden von beiden Bedingungen wurden entfernt. Zusätzlich für die Tl-Quencher Messungen wiederholen 8 muss durch Artefakte, wahrscheinlich Luftblasen entfernt werden. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> . Abbildung 5: Wirkung von Capsaicin (Cap) an den zeitlichen Verlauf der ANTS Fluoreszenzlöschung (A) Normalisierte Fluoreszenzsignal über 1 s, bezeichnen graue Punkte Ergebnisse aus allen Wiederholungen (n&gt; 5 pro Bedingung); roten Linien bezeichnen den Mittelwert aller Wiederholungen. (B) Die ersten 100 ms, bezeichnen graue Punkte ergibt sich aus einer einzigen Wiederholung für jede Bedingung, roten Linien sind exponentielle passt (von 2 bis 100 ms) gestreckt, um die Wiederholungen. Die gestrichelte blaue Linie zeigt die 2 ms markieren, zu welchem ​​Zeitpunkt die Rate der Abschreckung bestimmt wird. In beiden A und B die obere Kurve zeigt die Ergebnisse in der Abwesenheit von Tl +, der nächsten zwei Spuren zeigen die Ergebnisse in der Abwesenheit von gA, mit Tl + ± Cap; die vier unteren Spuren zeigen die Ergebnisse mit 260 nM gA und Tl +, wo Die Zahlen bedeuten [Cap] in uM. Die Preise der Abschreckung für 0, 10, 30 und 90 uM Cap, als durch die Geschwindigkeit der eine gestreckte Exponentialfunktion bestimmt, 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 und 247 ± 27 (Mittelwert ± Standardabweichung, n&gt; 8) bzw..

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Eine vorläufige Patentanmeldung, dass die Methoden in dem Manuskript beschrieben deckt eingereicht worden ist. Die Co-Erfinder sind HII und OSA.

Wir haben eine schnelle Fluoreszenz-basierter Assay für die Bestimmung der Doppelschicht Änderung Potential von Medikamenten und anderen kleinen Amphiphile demonstriert. Verbindungen, die Doppelschicht Eigenschaften zu verändern dürften membrane protein-Funktion in eine indirekte, unspezifische Art und Weise verändern, möglicherweise einen Beitrag zur &quot;off-target&quot; Arzneimittelwirkungen. Der Test nutzt die Leistung von Gramicidin Kanäle als Sonden für die Veränderungen in Doppelschicht Eigenschaften <s...

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		<tr>
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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ANTS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gramicidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Chemical Co</td>
<td>G-5002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850398C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini-Extruder kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PD-10 Desalting column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare</td>
<td>54805</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties

Viele Medikamente und andere kleine Moleküle zur Modulation biologischen Funktion sind Amphiphile, die Adsorption an der Doppelschicht / Lösung-Grenzfläche und damit Lipiddoppelschicht Eigenschaften zu verändern. Dies ist wichtig, weil Membranproteine ​​energisch an ihre Host-Doppelschicht durch hydrophobe Wechselwirkungen gekoppelt. Änderungen in Doppelschicht Eigenschaften verändern somit membrane protein-Funktion, die einen indirekten Weg für Amphiphile modulieren Protein-Funktion und einen möglichen Mechanismus für &quot;off-target&quot; Arzneimittelwirkungen zu Verfügung stellt. Wir haben bereits eine elektrophysiologische Assay zum Nachweis von Veränderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften mittels linearer Gramicidin Kanäle als Sonden 3,12 entwickelt. Gramicidin-Kanäle sind Mini-Proteine ​​durch die Transbilayer Dimerisierung von zwei nicht-leitenden Untereinheiten gebildet. Sie reagieren empfindlich auf Veränderungen in ihrer Membran-Umgebung, die ihnen leistungsfähige Sonden zur Überwachung von Veränderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften wie spürte durch Doppelschicht Spanning Proteine ​​macht. Wir zeigen jetzt, ein Fluoreszenz-Assay zum Nachweis von Veränderungen in Doppelschicht Eigenschaften mit den gleichen Kanälen wie Sonden. Der Test basiert auf der Messung der zeitliche Verlauf der Fluoreszenzlöschung von Fluorophor-geladen große unilamellare Vesikel durch die Eingabe einer Quencher durch die Gramicidin-Kanäle auf. Wir nutzen die Fluoreszenz-Anzeige / Quencher-Paar 8-Aminonaphthalin-1 ,3,6-trisulfonat (ANTS) / Tl. +, Mit der bereits in anderen Fluoreszenzlöschung Assays 5,13 verwendet Tl + durchdringt die Lipid-Doppelschicht langsam 8, sondern geht leicht durch die Durchführung Gramicidin Kanäle 1,14. Die Methode ist skalierbar und eignet sich sowohl für mechanistische Studien-und High-Throughput-Screening von kleinen Molekülen für Doppelschicht-stören, und das Potenzial &quot;off-target&quot;, Effekte. Wir finden, dass die Ergebnisse mit dieser Methode in guter Übereinstimmung mit früheren elektrophysiologischen Ergebnisse 12 sind.

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Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Wir stellen Ihnen eine schnelle Fluoreszenz-basierter Assay, dass die Rate der Fluoreszenzlöschung als Maß für Gramicidin-Kanal-Aktivität überwacht. Die Gramicidin Kanäle sind als molekulare Kraftaufnehmer verwendet, um Änderungen in Lipiddoppelschicht Eigenschaften wie spürte durch Doppelschicht Spanning Proteine ​​zu überwachen.

Gramicidin-basierte Fluoreszenz-Assay; zur Bestimmung Small Molecules Potential für das Ändern von Lipid-Doppelschicht-Eigenschaften

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

gramicidin-based-fluorescence-assay-for-determining-small-molecules

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Serie: Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

Die Anwendung eines C. elegans Dopamin Neuron Degeneration Assay für die Validierung von potenziellen Parkinson Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Forschung

Biologie

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Single Molecule Methoden zur Überwachung von Veränderungen in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Substrat Generation für Endonukleasen der CRISPR / Cas-Systeme

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Hoch effiziente Ligation kleine RNA-Moleküle für MicroRNA Quantifizierung von Hochdurchsatz-Sequenzierung

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Bestimmen Membrane Protein Topologie Mit Fluorescence Protease Schutz (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

Angebundene Doppelschicht-Lipidmembranen zur Überwachung der Wärmeübertragung zwischen Goldnanopartikeln und Lipidmembranen

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In addition, autofluorescence attributed to chlorophyll hampers the observation of fluorescent proteins in plants. For a long time, various clearing reagents have been used to make plants transparent. However, conventional clearing reagents diminish fluorescent signals; therefore, it has not been possible to observe the cellular and intracellular structures with fluorescent proteins. Reagents were developed that can clear plant tissues by removing chlorophyll while maintaining fluorescent protein stability. A detailed protocol is provided here for the optical clearing of plant tissues using clearing reagents, ClearSee (CS) or ClearSeeAlpha (CSA). The preparation of cleared plant tissues involves three steps: fixation, washing, and clearing. Fixation is a crucial step in maintaining the cellular structures and intracellular stability of fluorescent proteins. The incubation time for clearing depends on the tissue type and species. In Arabidopsis thaliana, the time required for clearing with CS was 4 days for leaves and roots, 7 days for seedlings, and 1 month for pistils. CS also required a relatively short time of 4 days to make the gametophytic leaves of Physcomitrium patens transparent. In contrast, pistils in tobacco and torenia produced brown pigment due to oxidation during CS treatment. CSA reduced the brown pigment by preventing oxidation and could make tobacco and torenia pistils transparent, although it took a relatively long time (1 or 2 months). CS and CSA were also compatible with staining using chemical dyes, such as DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and Hoechst 33342 for DNA and Calcofluor White, SR2200, and Direct Red 23 for the cell wall. This method can be useful for whole-plant imaging to reveal intact morphology, developmental processes, plant-microbe interactions, and nematode infections.

Here, a method is described for making plant tissues transparent while maintaining the stability of fluorescent proteins. This technique facilitates deep imaging of cleared plant tissues without physical sectioning.

Optische Reinigung von Pflanzengeweben für die Fluoreszenzbildgebung

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...