Agradecemos a Michael J. Bruno, Radda Rusinova e Jon T. Sack para muitas discussões estimulantes. Apoio financeiro do NIH, R01GM021342 e complementar ARRA R01GM021342-35S1, ea Josiah Macy, Jr. da Fundação para a SAOS, o Tri-I programa CMB para HII, e L. A Iris e Leverett S. Woodworth Medical Fellowship Scientist e NIH MSTP conceder GM07739 para RK.

1. Gerar ANTS cheio de Lipossomas <ol><li> No dia 1, remover solvente orgânico a partir de lipídios. </li><li> Retire do freezer de lipídios e deixá-lo atingir a temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 0,6 mL de 25 mg / mL (1,2-dierucoyl-sn-glicero-3-fosfocolina) lipídico em clorofórmica solução para um balão de fundo 25 mL rodada. </li><li> Continuamente girar o frasco durante a secagem em nitrogênio, até que todos os clorofórmio tenha evaporado e uma fina película branca de camadas lipídicas toda a metade inferior do balão. </li><li> Seco em um dessecador sob vácuo durante a noite. </li></ol><ol><li> No dia 2, prepare a amostra com o fluoróforo que serão incorporados nas vesículas. </li><li> Reidratar em 100 mM NaNO 3, 25 mM ANTS (Na sal), 10 mM HEPES. Use HNO 3 ou NaOH para ajustar o pH para 7,0. Cada molécula de formigas tem 2 + Na, para um total de 150 mM [Na +]. Adicionar 1,671 mL de eletrólito para obter uma suspensão lipídica 10 mM. </li><li> Parafilme e vortex suspensão completamente. </li><li> Proteger amostra da luz com papel alumínio e deixe-a idade em temperatura ambiente durante a noite. </li></ol><ol><li> No dia 3, fazer grandes vesículas unilamelares e remover todos os fluoróforo de fora das vesículas. </li><li> Sonicate por 1 min em um sonicador de baixa potência. </li><li> Congelamento e descongelamento da amostra 5-6 vezes, cada vez com 5 minutos em gelo seco e 5 minutos em água morna (~ 50 ° C) de água. </li><li> Extrude a suspensão lipídica usando uma mini-extrusora Avanti. Configurar o mini-extrusora com um filtro de 0,1 mícron de policarbonato e suportes dos filtros (ver extrusora manual para detalhes). Extrude a suspensão e voltar 21 vezes de tal forma que a suspensão acaba na seringa oposto. Quando vários lotes são extrudados, lembre-se sempre para carregar amostras com a mesma seringa. Durante a extrusão da suspensão lipídica nublado inicial deve-se quase translúcido (ainda vai ser amarelo devido ao fluoróforo ANTS). Se a extrusão de repente se torna mais fácil e menos pressão é necessária para mover através do filtro, o filtro pode ter rompido e precisa ser substituído. </li><li> Remover ANTS externa, executando a suspensão extrudados através de uma coluna de dessalinização PD-10 usando um protocolo de gravidade. Equilibrar coluna com 20-30 mL de Na-tampão (140 mM NaNO 3, 10 mM HEPES, pH 7.0, lembre-se de usar HNO 3 ou NaOH para ajustar o pH). Adicionar 1,5 mL da suspensão lipídica extrudado para a coluna e deixá-lo escoar dentro Traga o volume total da amostra para 2,5 mL, adicionando 1 mL Na-buffer. Após o buffer é totalmente incorporada na coluna e nada está vazando, eluir os lipossomas com 3 mL de Na-buffer e coletar a amostra resultante. O ANTS resultando cheia LUV solução de reserva deve conter cerca de lipídios mM 4-5 e aparecem translúcido branco leitoso. Proteger a amostra da luz com papel alumínio. </li><li> Se a solução de reserva não for utilizado imediatamente loja, a 13 ° C para um máximo de 7 dias. Atenção: não congelar ou resfriar a solução de lipídios abaixo do seu líquido-cristal a fase de temperatura (~ 12 ° C), pois isso irá destruir a integridade da vesícula e do fluoróforo irá vazar transição. </li></ol> 2. Mix Solução de fluorescência <ol><li> 24 horas antes do uso, diluir lipossomas e incubar com gramicidin (a 13 ° C). Equilíbrio de gramicidin entre monocamadas as vesículas lipídicas &quot;interna e externa é um processo lento, exigindo uma longa incubação. </li><li> Vortex completamente o ANTS-cheia LUV solução de ações como a luvs têm uma densidade&gt; 1 g / mL e, portanto, de sedimentos nas soluções. </li><li> Misture o ANTS-cheia LUV 01:20 ações de Na-buffer. Misture todos os lipossomas para uso em um dia de experiências juntos em um único frasco para melhorar a uniformidade da amostra. </li><li> Separar 04/03 dos lipossomas e adicionar 260 Nm gramicidin pré-diluído em DMSO (500 mcg / mL). </li><li> Para os restantes 04/01 adicionar o mesmo volume de DMSO (sem gramicidin) para manter a concentração do solvente constante em todas as amostras. </li></ol> 3. Configuração do aparelho de fluorescência <ol><li> Usamos um Fotofísica Aplicada SX.20 espectrofluorímetro stopped-flow com controle de temperatura para medir a taxa de extinção de fluorescência. </li><li> Vire os instrumentos em uma hora de antecedência para permitir o aquecimento. Os componentes são: computador, unidade de controle eletrônico, banho-maria (ambos refrigerador e aquecedor), fonte de alimentação da lâmpada e tanque de nitrogênio. </li><li> Criar as condições de gravação utilizando o software Pro-Data SX. </li><li> Definir o comprimento de onda de excitação a 352 nm monocromador e aberturas largura da fenda de excitação para 01/01. </li><li> Usar um λ = 455 nm filtro passa-alta para gravar a emissão. </li><li> Use a &quot;pressão Hold&quot; configuração, que permite que o instrumento para manter a pressão de nitrogênio durante a gravação e, assim, evita oscilações de pressão (e artefatos de gravação) durante o primeiro poucos milissegundos. </li><li> Conjunto de &quot;Time &quot;para um s e&quot; Pontos &quot;para 5000. </li><li> Use a caixa de repetir e ajustar o número de repetições, normalmente usamos 9 e 13 repetições para buffer e funciona quencher, respectivamente. </li><li> Banho-maria a temperatura deve ser ajustado para 25 ° C, a temperatura deve ser monitorada no software SX. </li><li> Definir o volume do disco para 120 mL, o que significa que cada vez que o instrumento funciona uma amostra, mistura 60 mL de cada uma das duas seringas. Com esta configuração instrumental, um volume de 120 mL dá um tempo morto de ≈ 1,2 ms. </li><li> Ajustar a tensão alta (ganho) sobre o detector de fluorescência para a saída do ANTS-lipossomas de ser em torno de 8. Para uma mistura padrão experimental o ganho deve ser 400-420 V. Algumas drogas são fluorescentes, de tal forma que eles podem saturar o sinal de fluorescência. Nestes casos, o ganho / tensão deve ser diminuída. </li><li> Sempre carregue a amostra fluorescente dentro da seringa para a esquerda e buffer / quencher na seringa direita. Certifique-se completamente vórtice todas as amostras contendo lipossomas antes do carregamento, e estar ciente de que o luvs com o tempo vai resolver na seringa. </li></ol> 4. Fazendo uma experiência <ol><li> Prepare uma amostra de ANTS-carregado luvs com qualquer solvente ou composto, e carregar no espectrofluorímetro juntamente com tanto Na-tampão ou Tl-quencher (50 mM TlNO 3, 94 mM NaNO 3, 10 mM HEPES pH 7,0). </li><li> Use 1,5 ml diluída ANTS-LUV solução, com ou sem gramicidin, preparado no dia anterior. </li><li> Adicionar o composto na concentração desejada ou o solvente para controles. Manter a concentração de solvente a um mínimo e constante em todas as amostras. As concentrações terá de ser ajustada com qualquer composto (desconhecido) nova para alcançar o desejado intervalo de dose-resposta. Incubar por 10 min a 25 ° C no escuro. </li><li> Vortex do LUV amostra e carregar para dentro da seringa esquerda. Carregar o Na-tampão ou Tl-quencher dentro da seringa direita. </li><li> Eliminar completamente as bolhas de ar de ambas as amostras, empurrando as seringas e para trás. </li><li> Certifique-se de ambas as seringas são carregados igualmente antes de fechar as válvulas. Carregamento desigual irá resultar em pré-mistura de soluções antes de chegar a câmara de gravação. </li><li> Para a amostra primeiro, o registro da fluorescência com o Na-tampão, repita quatro vezes, ajustar a tensão alta (ganho) como necessário, e repita 5 vezes. </li><li> Para as demais amostras, registro 9 repete com Na-buffer. </li><li> Na substituir o tampão com o Tl-quencher e recorde de 13 repetições. </li><li> Lavar com água e continuar com a amostra seguinte. Como controles usamos amostras com: no gramicidin e com solvente, não gramicidin e com a concentração de compostos máxima, com ambos os gramicidin e solvente. </li></ol> 5. Dados da análise <ol><li> Transferir os resultados para o computador de análise. Ler todos os dados em MATLAB para a análise. Para cada amostra, lido em todas as tampão e repete quencher, excluindo os quatro primeiros em cada caso, como os artefatos contêm mistura. Assumindo um volume de 120 mL disco que leva um pouco menos de quatro tiros para limpar completamente a mistura anterior do tubo stopped-flow. </li><li> O tampão repete para todas as amostras devem ser muito semelhantes. Se houver uma mudança significativa no sinal de fluorescência, o que depende da concentração composto, em seguida, o composto em si pode ser fluorescente e pode ser necessário para a primeira subtrair o sinal de fluorescência extras antes de normalizar as amostras. </li><li> Manualmente através dos traços e remover &quot;mau&quot; repete: repete contendo picos ou desvios multi-exponencialidade devido a artefatos de mistura e / ou bolhas. </li><li> Normalizar a repete quencher ao valor médio inicial da repetições de buffer para cada amostra. Combine as médias de todas as amostras em um gráfico para visualização. </li><li> Traços gravados sem gramicidin devem ser todos semelhantes e mostram quase extinção ausência de fluorescência, pode haver uma redução lenta no sinal de fluorescência devido ao lento vazamento de Tl + através da bicamada vesículas 8. Se a amostra sem gramicidin e nenhum modificador mostra quenching significativo, então as vesículas se deterioraram e não deve ser usado posteriormente. Se as amostras sem gramicidin mas com o modificador de mostrar quenching significativo, então o modificador perturba a bicamada vesículas de tal forma que permite que o fluoróforo ou quencher para atravessar a bicamada. </li><li> Se o composto altera propriedades bicamada lipídica, como percebida pelos canais gramicidin, o tempo de fluorescência será visivelmente alterado. </li><li> Para cada amostra, uma exponencial esticada <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg1.jpg" alt="Equação 1" /> por exemplo, 4) está apto para o primeiro 200-100 ms da curva de extinção de fluorescência normalizado do indivíduo e repete a taxa de <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg2.jpg" alt="Figura 2" /> 4calculado em 2 ms. Médias e desvios-padrão são calculados para uma dada amostra de todas as repete individual. </li><li> Finalmente, determinar a mudança relativa na taxa de saciar normalizando com a amostra mais próxima de controle em tempo que gramicidin e nenhum modificador. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Os fundamentos do ensaio saciar baseado fluorescência para detectar mudanças nas propriedades bicamada lipídica Top left:. A zoom-in em uma vesícula de lipídios único com ANTS mais NaNO 3 no interior e NaNO 3 mais TlNO três no exterior. Superior direito: O sinal de fluorescência gravados utilizando (forma de cima para baixo) ANTS cheio de vesículas sem quencher, com quencher, com quencher e pré-dopado com 87, 260 e 780 gramicidin nM. Inferior: Representação esquemática da câmara de fluxo interrompido de mistura. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: A captura de tela a partir do software SX Pro-Data ilustrando os vários painéis de referência na descrição da configuração experimental. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3:. Determinações repetir múltiplas do sinal de fluorescência de formigas-carregado com luvs Na-tampão Os primeiros quatro repetições são sempre excluídos, pois eles contêm artefatos de mistura. A tubulação que liga o seringas de amostra para a célula de mistura tem um volume definido, por isso se repete primeiros nos dará uma leitura do que estava anteriormente na tubulação: água para repetir 1 e 2, uma combinação de água e amostra para repetir 3, na maior parte da amostra para repetir 4, e apenas uma amostra para o restante repete. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4:. Determinações repetir múltiplas do sinal de fluorescência de formigas-carregado com luvs Na-tampão e com Tl-quencher Os primeiros quatro repetições foram removidos de ambas as condições. Além disso, para as medições Tl quencher, repita 8 precisa ser removido devido a artefatos, bolhas de ar mais provável. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig5.jpg" alt="Figura 5" /> . Figure 5: Efeito da capsaicina (Cap) sobre o curso tempo de ANTS extinção de fluorescência (A) sinal de fluorescência normalizada mais de 1 s, cinza pontos denotam os resultados de todas as repetições (n&gt; 5 por condição); linhas vermelhas indicam a média de todos repete. (B) Os primeiros 100 ms, cinza pontos denotam os resultados de uma repetição único para cada condição; linhas vermelhas são esticadas encaixa exponencial (2-100 ms) para as repetições. A linha pontilhada azul indica o 2 ms marca, o momento em que a taxa de extinção é determinado. Em ambos A e B o traço superior mostra resultados na ausência de Tl +; os próximos dois traços mostrar resultados na ausência de GA, com Tl + ± Cap, os quatro traços inferiores mostram resultados com 260 nM e gA + Tl, onde os números denotam [Cap] em mM. As taxas de extinção de 0, 10, 30 e 90 Cap M, conforme determinado pela taxa de uma exponencial esticada, são 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 e 247 ± 27 (média ± dp, n&gt; 8) , respectivamente.

<ol>
	<li>Andersen, O. S., Giebisch, G. H., Purcel, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+transport+through+simple+membranes.">Ion transport through simple membranes.</a> Renal Function. , (1978).</li><li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+thickness+and+membrane+protein+function:+An+energetic+perspective.">Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 107-130 (2007).</li><li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E., Roux, B., Chung, S. -. H., Andersen, O. S., Krishnamurthy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gramicidin+channels.+Versatile+tools.">Gramicidin channels. Versatile tools.</a> Biological Membrane Ion Channels: Dynamics, Structure, and Applications. , (2007).</li><li>Berberan-Santos, M. N., Bodunov, E. N., Valeur, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+functions+for+the+analysis+of+luminescence+decays+with+underlying+distributions+1.+Kohlrausch+decay+function+(stretched+exponential.">Mathematical functions for the analysis of luminescence decays with underlying distributions 1. Kohlrausch decay function (stretched exponential.</a> Chem. Phys. 315, 171-182 (2005).</li><li>Bruggemann, E. P., Kayalar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+molecularity+of+the+colicin+E1+channel+by+stopped-flow+ion+flux+kinetics.">Determination of the molecularity of the colicin E1 channel by stopped-flow ion flux kinetics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 4273-4276 (1986).</li><li>Bruno, M. J., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid+alters+bilayer+elastic+properties.">Docosahexaenoic acid alters bilayer elastic properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 9638-9643 (2007).</li><li>Buboltz, J. T., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+the+preparation+of+liposomes:+rapid+solvent+exchange.">A novel strategy for the preparation of liposomes: rapid solvent exchange.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1417, 232-245 (1999).</li><li>Gutknecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadmium+&#38;+thallous+ion+permeabilities+through+lipid+bilayer+membranes.">Cadmium &#38; thallous ion permeabilities through lipid bilayer membranes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 735, 185-188 (1983).</li><li>Ing&#243;lfsson, H. I., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+is+a+modulator+of+bilayer+material+properties.">Curcumin is a modulator of bilayer material properties.</a> Biochemistry. 46, 10384-10391 (2007).</li><li>Keser&#252;, G. M., Makara, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+lead+discovery+strategies+on+the+properties+of+drug+candidates.">The influence of lead discovery strategies on the properties of drug candidates.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 8, 203-212 (2009).</li><li>Leeson, P. D., Springthorpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+drug-like+concepts+on+decision-making+in+medicinal+chemistry.">The influence of drug-like concepts on decision-making in medicinal chemistry.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 6, 881-890 (2007).</li><li>Lundb k, J. A., Collingwood, S. A., Ing&#243;lfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S., S, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+regulation+of+membrane+protein+function:+gramicidin+channels+as+molecular+force+probes.">Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes.</a> J. R. Soc. Interface. 7, 373-395 (2010).</li><li>Moore, H. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Raftery, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+spectroscopic+studies+of+cation+translocation+by+Torpedo+acetylcholine+receptor+on+a+time+scale+of+physiological+relevance.">Direct spectroscopic studies of cation translocation by Torpedo acetylcholine receptor on a time scale of physiological relevance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4509-4513 (1980).</li><li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+specificity+of+the+gramicidin+channel+and+the+thallous+ion.">Ionic specificity of the gramicidin channel and the thallous ion.</a> Biochim. Biophys. Acta. 401, 540-544 (1975).</li><li>O'Connell, A. M., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+gramicidin+channel+formation+in+lipid+bilayers:+transmembrane+monomer+association.">Kinetics of gramicidin channel formation in lipid bilayers: transmembrane monomer association.</a> Science. 250, 1256-1259 (1990).</li><li>S&#248;gaard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+function+is+regulated+by+lipid+bilayer+elasticity.">GABAA receptor function is regulated by lipid bilayer elasticity.</a> Biochemistry. 45, 13118-13129 (2006).</li><li>Waring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+optimum+lipophilicity+and+molecular+weight+ranges+for+drug+candidates-Molecular+weight+dependent+lower+logD+limits+based+on+permeability.">Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2844-2851 (2009).</li></ol>

A pedido provisório de patente que cobre os métodos descritos no manuscrito foi apresentado. O co-inventores são HII e OSA.

Nós demonstramos um ensaio de fluorescência baseada rápido para determinar o potencial de modificar bicamada de drogas e outros anfifílicos de pequeno porte. Compostos que modificam propriedades bicamada são susceptíveis de alterar a função da membrana de proteína de uma maneira indireta inespecífica, possivelmente contribuindo para &quot;fora do alvo&quot; efeitos de drogas. O ensaio explora o poder dos canais de gramicidin como sondas para mudanças nas propriedades bicamada 12 que são sentidos p...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ANTS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gramicidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Chemical Co</td>
<td>G-5002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850398C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini-Extruder kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PD-10 Desalting column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare</td>
<td>54805</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties

Muitas drogas e outras moléculas pequenas usadas para modular a função biológica são anfifílicos que adsorvem na interface bicamada / solução e, assim, alterar as propriedades de bicamada lipídica. Isto é importante porque as proteínas da membrana são energeticamente acoplado a sua bicamada acolhimento por interações hidrofóbicas. Alterações nas propriedades bicamada, assim, alterar a função da membrana de proteína, que fornece uma maneira indireta de anfifílicos para modular a função das proteínas e um possível mecanismo para &quot;fora do alvo&quot; efeitos de drogas. Nós já desenvolveram um ensaio para a detecção de alterações eletrofisiológicas nas propriedades bicamada lipídica utilizando canais gramicidin linear como sondas 3,12. Canais gramicidina são mini-proteínas formadas pela dimerização transbilayer de duas subunidades não-condutor. Eles são sensíveis a mudanças em seu ambiente de membrana, o que os torna sondas poderosa para acompanhamento da evolução das propriedades bicamada lipídica como sentiu por proteínas bicamada de expansão. Nós agora demonstrar um ensaio de fluorescência para a detecção de alterações nas propriedades bicamada utilizando os mesmos canais como sondas. O ensaio é baseado na medição do tempo de percurso de extinção de fluorescência de fluoróforo-carregado vesículas unilamelares grandes devido à entrada de um supressor através dos canais gramicidin. Usamos o par indicador / supressor de fluorescência 8-aminonaftaleno-1 ,3,6-trisulfonate (ANTS) / Tl + que tem sido utilizado com sucesso em outros ensaios extinção de fluorescência 5,13. Tl + permeia a bicamada lipídica lentamente 8, mas passa facilmente através da realização de canais gramicidin 1,14. O método é escalável e adequado tanto para estudos mecanísticos e high-throughput screening de moléculas pequenas para bicamada perturbando, e potencial &quot;fora do alvo&quot;, os efeitos. Nós achamos que os resultados obtidos utilizando este método estão em boa concordância com resultados anteriores eletrofisiológicas 12.

Watch this Scientific Journal Video about Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties at JoVE.com

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Nós introduzimos um ensaio de fluorescência baseada rápido que monitora a taxa de extinção de fluorescência como uma medida da atividade do canal gramicidin. Os canais gramicidin são usados ​​como transdutores de força molecular para monitorar as mudanças nas propriedades bicamada lipídica como sentiu por proteínas bicamada de expansão.

Gramicidina baseado em Ensaio de fluorescência; para determinar Moléculas Pequenas Potencial para Modificação de Propriedades bicamada lipídica

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

gramicidin-based-fluorescence-assay-for-determining-small-molecules

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K visualizações.  Weill Cornell Medical College. Nós introduzimos um ensaio de fluorescência baseada rápido que monitora a taxa de extinção de fluorescência como uma medida da atividade do canal gramicidin. Os canais gramicidin são usados ​​como transdutores de força molecular para monitorar as mudanças nas propriedades bicamada lipídica como sentiu por proteínas bicamada de expansão.

Vídeo: Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Métodos única molécula para acompanhar as alterações nas propriedades elásticas bicamada

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Biologia

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Geração de substrato para Endonucleases de CRISPR / Cas Sistemas

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Ligadura altamente eficiente de pequeno RNA moléculas microRNA para quantificação por sequenciamento de alto rendimento

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Determinando Membrane Topology Protein Usando Fluorescência Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

Membranas lipídicas de bicamadas tethered para monitorar a transferência de calor entre nanopartículas de ouro e membranas lipídicas

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In addition, autofluorescence attributed to chlorophyll hampers the observation of fluorescent proteins in plants. For a long time, various clearing reagents have been used to make plants transparent. However, conventional clearing reagents diminish fluorescent signals; therefore, it has not been possible to observe the cellular and intracellular structures with fluorescent proteins. Reagents were developed that can clear plant tissues by removing chlorophyll while maintaining fluorescent protein stability. A detailed protocol is provided here for the optical clearing of plant tissues using clearing reagents, ClearSee (CS) or ClearSeeAlpha (CSA). The preparation of cleared plant tissues involves three steps: fixation, washing, and clearing. Fixation is a crucial step in maintaining the cellular structures and intracellular stability of fluorescent proteins. The incubation time for clearing depends on the tissue type and species. In Arabidopsis thaliana, the time required for clearing with CS was 4 days for leaves and roots, 7 days for seedlings, and 1 month for pistils. CS also required a relatively short time of 4 days to make the gametophytic leaves of Physcomitrium patens transparent. In contrast, pistils in tobacco and torenia produced brown pigment due to oxidation during CS treatment. CSA reduced the brown pigment by preventing oxidation and could make tobacco and torenia pistils transparent, although it took a relatively long time (1 or 2 months). CS and CSA were also compatible with staining using chemical dyes, such as DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and Hoechst 33342 for DNA and Calcofluor White, SR2200, and Direct Red 23 for the cell wall. This method can be useful for whole-plant imaging to reveal intact morphology, developmental processes, plant-microbe interactions, and nematode infections.

Here, a method is described for making plant tissues transparent while maintaining the stability of fluorescent proteins. This technique facilitates deep imaging of cleared plant tissues without physical sectioning.

Limpeza Óptica de Tecidos Vegetais para Imagem de Fluorescência

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

A Fluorescence-Based Assay of Membrane Potential for High-Throughput Functional Study of Two Endogenous Ion Channels in Two Epithelial Cell Lines

Fluorescence-based studies are suitable for high-throughput plate reader assays of cells in culture. They have been commonly employed for drug discovery campaigns targeting recombinant ion channel proteins overexpressed in cells such as HEK-293 cells. However, there is increasing emphasis on the use of tissue-relevant cell lines for studying the effects of small molecule interventions. The following protocol describes the adaptation of a fluorescence-based membrane potential assay for the study of ion channels endogenously expressed in epithelial cell lines. The membrane potential assay details a high-throughput assay for chloride channel activity of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) in two commonly studied epithelial cell lines, Caco-2 and Calu-3. In addition, this paper describes a novel application of this system to measure the activity of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) in a high-throughput format in the same epithelial cell lines. Together, these fluorescence-based assays provide a robust and flexible platform for studying small molecule modulators, targeting two epithelial channels in a relevant cellular context.

This protocol describes a method for the study of electrogenic membrane proteins by measuring changes in membrane potential. This assay provides a platform for the functional readout of multiple ion channels endogenously expressed in epithelial cell lines.

Ensaio de Potencial de Membrana Baseado em Fluorescência para Estudo Funcional de Alto Rendimento de Dois Canais Iônicos Endógenos em Duas Linhagens Celulares Epiteliais

Fluorescence-based studies are suitable for high-throughput plate reader assays of cells in culture. They have been commonly employed for drug discovery ...