אנו מודים מייקל ג&#39;יי ברונו, Radda Rusinova וג&#39;ון ט שק לדיונים מגרה רבים. תמיכה כספית מ-NIH, R01GM021342 ואת ערה תוספת R01GM021342-35S1, ואת מייסי ג&#39;וניור יאשיהו קרן אל OSA, Tri-אני תוכנית קרינת הרקע הקוסמית עבור HII; ו ל איריס לוורט ס וודוורת רפואי המדען אחוות ו-NIH MSTP מענק GM07739 עבור ר.ק..

1. צור נמלים מלא ליפוזומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1, להסיר ממס אורגני מן שומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שומנים מהמקפיא ולתת לו לאזן לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.6 מ&quot;ל של 25 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(1,2-dierucoyl-SN-glycero-3-phosphocholine) שומנים בתמיסה כלורופורם כדי בקבוקון 25 מ&quot;ל תחתית עגולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרף לסובב את הבקבוק תוך ייבוש תחת חנקן, עד שכל כלורופורם התאדו וסרט לבן דק של מעילים השומנים שכל החלק התחתון של הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש dessicator תחת ואקום לילה. </li></ol><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, להכין את המדגם עם fluorophore כי ישולבו שלפוחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם מ&quot;מ 100 NANO 3, 25 נמלים מ&quot;מ (Na מלח), 10 HEPES מ&quot;מ. השתמש HNO 3 או NaOH להתאים את ה-pH 7.0. כל מולקולה נמלים יש 2 + Na, עבור סכום כולל של 150 מ&quot;מ [Na +]. הוספת 1.671 מ&quot;ל של אלקטרוליט לקבל השעיה 10 השומנים מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm ו מערבולת ההשעיה ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגן מדגם מן האור עם רדיד ולתת לו גיל בטמפרטורת החדר למשך הלילה. </li></ol><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, להפוך את שלפוחית ​​unilamellar גדול להסיר את כל fluorophore מבחוץ שלפוחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate דקות 1 ב sonicator צריכת חשמל נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא להפשיר מדגם 5-6 פעמים, בכל פעם עם 5 דקות על קרח יבש 5 דקות חם (~ 50 ° C) ומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Extrude את ההשעיה השומנים באמצעות אוואנטי מיני extruder. הגדרת מיני extruder עם 0.1 מיקרומטר פוליקרבונט לסנן ולסנן תומך (עיין במדריך extruder לפרטים נוספים). Extrude את ההשעיה קדימה ואחורה 21 פעמים כזה ההשעיה בסופו של דבר על מזרק הפוך. כאשר קבוצות מרובות נמתחים, זכור תמיד לטעון דגימות עם מזרק אחד. במהלך שחול ההשעיה מעונן השומנים הראשוני צריך להיות כמעט שקוף (הוא עדיין יהיה צהוב בשל fluorophore הנמלים). אם שחול פתאום הופך להיות יותר קל הלחץ פחות צורך לעבור דרך המסנן, המסנן יכול להיות מקרע ויהיה צריך להיות מוחלף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נמלים חיצוני על ידי הפעלת ההשעיה הנמתח על פני טור PD-10 desalting באמצעות פרוטוקול הכבידה. לאזן טור עם 20-30 מ&quot;ל של Na-חיץ (140 mM NANO 3, 10 HEPES מ&quot;מ, pH 7.0, לזכור להשתמש HNO 3 או NaOH להתאים את ה-pH). הוסף 1.5 מ&quot;ל של ההשעיה השומנים extruded לעמודה ולתת לו לחלחל פנימה להביא את סך היקף המדגם כדי mL 2.5 ידי הוספת 1 מ&quot;ל Na-חיץ. לאחר חיץ משולב במלואו לתוך הטור ושום דבר לא דולף החוצה, elute ליפוזומים עם 3 מ&quot;ל של Na-חיץ ולאסוף את המדגם שהתקבל. הנמלים וכתוצאה מכך מלא LUV פתרון המניות צריכה להכיל על שומני mM 4-5 מופיעים שקוף לבן חלבי. הגנה על מדגם מן האור עם רדיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הפתרון המניה אינו משמש באופן מיידי, חנות ב 13 ° C לכל היותר 7 ימים. אזהרה: לא להקפיא או לקרר את הפתרון השומנים מתחת לנוזל, הטמפרטורה שלה גביש בשלב המעבר (~ 12 ° C), כמו זה יהרוס את השלמות של שלפוחית ​​ואת fluorophore ידלפו החוצה. </li></ol> 2. מערבבים Fluorescence פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לפני השימוש, לדלל ליפוזומים ו דגירה עם gramicidin (ב 13 ° C). איזון של gramicidin בין monolayers הפנימיים והחיצוניים שלפוחית ​​&quot;השומנים היא תהליך איטי, המחייב דגירה ארוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת ביסודיות נמלים מלא LUV פתרון מניות כמו &#39;לאב&#39; יש צפיפות&gt; 1 גרם / מ&quot;ל ​​ועל כן משקעים בפתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את נמלים מלא LUV 1:20 המניות Na-חיץ. מערבבים את כל ליפוזומים לשימוש יום אחד הניסויים יחד בבקבוק אחד כדי לשפר את אחידות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את 3 / 4 של ליפוזומים ולהוסיף 260 nM gramicidin מראש מדולל DMSO (500 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי הנותרים 1 / 4 להוסיף באותו נפח של DMSO (ללא gramicidin) כדי לשמור על ריכוז קבוע ממס כל הדגימות. </li></ol> 3. הגדרת כלי פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים יישומי Photophysics SX.20 הפסיקה זרימת spectrofluorometer עם בקרת טמפרטורה למדוד את קצב של מרווה פלואורסצנציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את המכשירים על שעה לפני הזמן, כדי לאפשר חימום. הרכיבים הם: מחשב יחידה אלקטרוניות לבקרת מים, אמבטיה (שניהם מקרר ותנור חימום), אספקת החשמל המנורה מיכל חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת התנאים ההקלטה באמצעות תוכנת Pro-SX נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את עירור monochromator הגל 352 ננומטר רוחב פתחים חריץ עבור עירור עד 1 / 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש λ = 455 nm גבוהה לעבור סינון כדי להקליט את הפליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;תחזיק לחץ&quot; הגדרה, המאפשר את המכשיר כדי לשמור על לחץ חנקן במהלך ההקלטה, ובכך מונע תנודות בלחץ (וחפצי הקלטה) במהלך אלפיות השנייה הראשונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת &quot;טילי &quot;עד 1 s ו&quot; נקודות &quot;אל 5000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתיבת לחזור ולהתאים את מספר חזרות, בדרך כלל אנו משתמשים 9 ו - 13 חזרות על חיץ ומפעיל מרווה, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפרטורת המים באמבטיה צריך להיות מוגדר 25 ° C: הטמפרטורה צריכה להיות במעקב בתוכנה SX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את נפח הכונן μL 120, כלומר כל פעם המכשיר פועל מדגם, הוא מתערבב 60 μL מתוך כל אחד משני מזרקים. עם ההגדרה הזו אינסטרומנטלית, נפח μL 120 נותן זמן מת ≈ של 1.2 ms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מתח גבוה (רווח) על גלאי הקרינה עבור פלט של נמלים, liposome להיות סביב 8. לקבלת תערובת ניסיוני רגיל לזכות צריך להיות 400-420 V. חלק מהתרופות הם פלורסנט, כך הם יכולים להרוות את אותות הקרינה. במקרים אלה, רווח / מתח צריכה להיות ירידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד לטעון את מדגם ניאון לתוך המזרק שמאל חיץ / מרווה בתוך מזרק הנכון. הקפד מערבולת ביסודיות את כל דגימות המכילה ליפוזומים לפני הטעינה, ולהיות מודעים לכך &#39;לאב&#39; עם הזמן יהיה להתיישב המזרק. </li></ol> 4. עושה ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם של נמלים טעון &#39;לאב&#39; עם או ממס או תרכובת, לטעון לתוך spectrofluorometer יחד עם או Na-חיץ או TL-מרווה (50 mM TlNO 3, 94 mM NANO 3, 10 mM HEPES ב-pH 7.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ב 1.5 מ&quot;ל מדולל נמלים-LUV פתרון, עם או בלי gramicidin, שהוכן יום קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את התרכובת בריכוז הרצוי או ממס עבור פקדי. לשמור על ריכוז ממס על מינימום וקבוע בכל הדגימות. ריכוזים יהיה צריך להיות מותאם עם מתחם כלשהו (לא ידוע) חדש כדי להשיג את הרצוי מנה תגובה מגוון. דגירה של 10 דקות במהירות של 25 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס LUV מדגם לטעון לתוך מזרק שמאל. טען את Na-TL-חיץ או מרווה לתוך מזרק הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות להסיר בועות אוויר דגימות הן על ידי לחיצה על מזרקים קדימה ואחורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שני מזרקים נטענים באותה מידה לפני סגירת ברזים. טעינת Unequal תגרום מראש ערבוב של פתרונות לפני שהם מגיעים לתא הקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המדגם הראשון, להקליט את הקרינה עם Na-חיץ, לחזור 4 פעמים, להתאים את מתח גבוה (רווח) לפי הצורך, וחזור 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת דוגמיות הנותרים, 9 חוזר להקליט עם Na-חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את Na-חיץ עם TL-מרווה ולהקליט 13 חזרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים וממשיכים עם מדגם הבאה. כפי שולטת אנו משתמשים דגימות עם: לא gramicidin עם ממס, לא gramicidin ובריכוז מתחם מקסימלית, עם שני gramicidin ממס. </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תוצאות למחשב ניתוח. קרא את כל הנתונים לתוך MATLAB לניתוח. עבור כל דגימה, לקרוא למאגר כל וחוזר מרווה, למעט ארבעת הראשונים בכל מקרה, אלו מכילים ממצאים ערבוב. בהנחה נפח כונן של 120 μL זה לוקח קצת פחות מארבע יריות לחלוטין לנקות את התערובת הקודמת צינורות הפסיק-הזרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוזר חיץ עבור כל דגימות צריך להיות דומה מאוד. אם יש שינוי משמעותי האות הקרינה, אשר תלויה בריכוז המתחם, ואז את המתחם עצמו עשוי להיות פלורסנט ייתכן שיהיה צורך קודם לחסר זה אות הקרינה נוסף לפני נורמליזציה דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידנית לעבור עקבות ולהסיר &quot;הרע&quot; חוזר: חוזר ובו קוצים או סטיות exponentiality רב בשל ערבוב חפצים ו / או בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נרמל חוזר מרווה לערך החל הממוצע של חוזר חיץ עבור כל דגימה. שלב ממוצעים של כל הדגימות לתוך גרף אחד עבור להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקבות מוקלט עם gramicidin לא צריכים להיות דומים להראות כמעט שום מרווה פלואורסצנציה, ייתכן שיש ירידה איטית האות הקרינה בשל דליפה איטית של טי + דרך bilayer שלפוחית ​​8. אם המדגם עם gramicidin וללא משנה מראה מרווה משמעותי, אז שלפוחית ​​התדרדרו ולא אמור לשמש נוספת. אם דגימות עם gramicidin אבל לא משנה את ההצגה עם מרווה משמעותי, ולאחר מכן צירוף מדאיג bilayer שלפוחית ​​עד כדי כך שזה מאפשר fluorophore או מרווה לחצות את bilayer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המתחם משנה bilayer נכסים שומנים בדם, כמו חש ידי ערוצי gramicidin, במהלך הזמן הקרינה יהיה שונה בעליל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה, מתוח מעריכי <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg1.jpg" alt="משוואה 1" /> לדוגמא: 4) הוא כשיר הראשון 200-100 ms של עקומת מרווה מנורמל את הקרינה של הפרט חוזר ושיעור <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg2.jpg" alt="איור 2" /> 4מחושב על 2 ms. ממוצעים וסטיות תקן מחושבים למדגם נתון מכל חוזר על הפרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולבסוף, לקבוע את השינוי היחסי בקצב להרוות ידי נרמול המדגם לשלוט בזמן הקרוב כי יש gramicidin ולא משנה. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: היסודות של assay להרוות מבוססי פלואורסצנציה לזהות שינויים במאפייני bilayer השומנים למעלה משמאל:. זום על שלפוחית ​​השומנים יחיד עם נמלים פלוס NANO 3 ​​מבפנים ננו 3 פלוס TlNO 3 בחוץ. למעלה מימין: אות הקרינה רשמה משתמש (טופס מלמעלה למטה) נמלים מלא שלפוחיות ללא מרווה, עם מרווה, עם מרווה מראש מסוממים עם gramicidin nM 87, 260 ו - 780. למטה: ייצוג סכמטי של תא הפסיק זרימה ערבוב. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: צילום מסך מתוך התוכנה SX Pro-Data הממחישות את לוחות שונים הפניה בתיאור ההתקנה הניסוי. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3:. קביעות חוזרות מרובות של האות הקרינה מן נמלים טעון &#39;לאב&#39; עם Na-חיץ הראשון ארבע חזרות אינם נכללים תמיד, כפי שהם מכילים חפצים ערבוב. צינור המחבר את מזרקים מדגם לתא ערבוב יש נפח מוגדר, ולכן חוזר על הראשונות ייתן לנו קריאה של מה שהיה בעבר צינורות: מים לחזור על 1 ו 2, שילוב של מים דגימה לחזור 3, בעיקר מדגם עבור 4 לחזור, ופשוט לדוגמה עבור חוזר הנותרים. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4:. קביעות חוזרות מרובות של האות הקרינה מן נמלים טעון &#39;לאב&#39; עם Na-חיץ עם TL-מרווה הראשון ארבע חזרות הוסרו שני המצבים. בנוסף, עבור TL-מרווה מדידות, לחזור על 8 יש להסיר בשל חפצים, בועות אוויר סביר ביותר. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig5.jpg" alt="איור 5" /> . איור 5: השפעת קפסאיצין (שווי) על מהלך הזמן של מרווה נמלים פלואורסצנטי (א) אות הקרינה מנורמל מעל 1 s, נקודות אפורות לציין תוצאות מכל חזרות (n&gt; 5 לכל מצב); הקווים האדומים מציינים את הממוצע של כל חוזר. (ב) הראשון 100 ms, נקודות אפורות לציין נובע לחזור יחיד עבור כל תנאי; הקווים האדומים נמתחים מתאים מעריכי (2-100 ms) לאלה חוזר. הקו הכחול מציין את מנומרות 2 ms סימן, הזמן שבו שיעור מרווה נקבע. בשני A ו-B עקבות העליונה מראה תוצאות בהעדר טי +; את שני עקבות להראות תוצאות בהעדר GA, עם טי + שווי ±; ארבע עקבות להראות תוצאות נמוכות עם 260 nM GA ו טי +, שם המספרים מציינים [יתר] ב מיקרומטר. שיעורי מרווה עבור שווי 0, 10, 30 ו - 90 מיקרומטר, כפי שנקבע על ידי בשיעור של מעריכי מתוח, הם 36 ± 6, 69 ± 6, 8 ו - 85 ± 247 ± 27 (ממוצע ± סטיית תקן, n&gt; 8) , בהתאמה.

<ol>
	<li>Andersen, O. S., Giebisch, G. H., Purcel, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+transport+through+simple+membranes.">Ion transport through simple membranes.</a> Renal Function. , (1978).</li><li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+thickness+and+membrane+protein+function:+An+energetic+perspective.">Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 107-130 (2007).</li><li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E., Roux, B., Chung, S. -. H., Andersen, O. S., Krishnamurthy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gramicidin+channels.+Versatile+tools.">Gramicidin channels. Versatile tools.</a> Biological Membrane Ion Channels: Dynamics, Structure, and Applications. , (2007).</li><li>Berberan-Santos, M. N., Bodunov, E. N., Valeur, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+functions+for+the+analysis+of+luminescence+decays+with+underlying+distributions+1.+Kohlrausch+decay+function+(stretched+exponential.">Mathematical functions for the analysis of luminescence decays with underlying distributions 1. Kohlrausch decay function (stretched exponential.</a> Chem. Phys. 315, 171-182 (2005).</li><li>Bruggemann, E. P., Kayalar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+molecularity+of+the+colicin+E1+channel+by+stopped-flow+ion+flux+kinetics.">Determination of the molecularity of the colicin E1 channel by stopped-flow ion flux kinetics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 4273-4276 (1986).</li><li>Bruno, M. J., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid+alters+bilayer+elastic+properties.">Docosahexaenoic acid alters bilayer elastic properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 9638-9643 (2007).</li><li>Buboltz, J. T., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+the+preparation+of+liposomes:+rapid+solvent+exchange.">A novel strategy for the preparation of liposomes: rapid solvent exchange.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1417, 232-245 (1999).</li><li>Gutknecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadmium+&#38;+thallous+ion+permeabilities+through+lipid+bilayer+membranes.">Cadmium &#38; thallous ion permeabilities through lipid bilayer membranes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 735, 185-188 (1983).</li><li>Ing&#243;lfsson, H. I., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+is+a+modulator+of+bilayer+material+properties.">Curcumin is a modulator of bilayer material properties.</a> Biochemistry. 46, 10384-10391 (2007).</li><li>Keser&#252;, G. M., Makara, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+lead+discovery+strategies+on+the+properties+of+drug+candidates.">The influence of lead discovery strategies on the properties of drug candidates.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 8, 203-212 (2009).</li><li>Leeson, P. D., Springthorpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+drug-like+concepts+on+decision-making+in+medicinal+chemistry.">The influence of drug-like concepts on decision-making in medicinal chemistry.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 6, 881-890 (2007).</li><li>Lundb k, J. A., Collingwood, S. A., Ing&#243;lfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S., S, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+bilayer+regulation+of+membrane+protein+function:+gramicidin+channels+as+molecular+force+probes.">Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes.</a> J. R. Soc. Interface. 7, 373-395 (2010).</li><li>Moore, H. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Raftery, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+spectroscopic+studies+of+cation+translocation+by+Torpedo+acetylcholine+receptor+on+a+time+scale+of+physiological+relevance.">Direct spectroscopic studies of cation translocation by Torpedo acetylcholine receptor on a time scale of physiological relevance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4509-4513 (1980).</li><li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+specificity+of+the+gramicidin+channel+and+the+thallous+ion.">Ionic specificity of the gramicidin channel and the thallous ion.</a> Biochim. Biophys. Acta. 401, 540-544 (1975).</li><li>O'Connell, A. M., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+gramicidin+channel+formation+in+lipid+bilayers:+transmembrane+monomer+association.">Kinetics of gramicidin channel formation in lipid bilayers: transmembrane monomer association.</a> Science. 250, 1256-1259 (1990).</li><li>S&#248;gaard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+function+is+regulated+by+lipid+bilayer+elasticity.">GABAA receptor function is regulated by lipid bilayer elasticity.</a> Biochemistry. 45, 13118-13129 (2006).</li><li>Waring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+optimum+lipophilicity+and+molecular+weight+ranges+for+drug+candidates-Molecular+weight+dependent+lower+logD+limits+based+on+permeability.">Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2844-2851 (2009).</li></ol>

יישום הפטנט הזמני שמכסה את השיטות המתוארות בכתב היד הוגשה. שיתוף הממציאים הם HII ו OSA.

יש לנו הפגינו assay מהיר הקרינה מבוססי לקביעת פוטנציאל bilayer שינוי של תרופות amphiphiles קטנים אחרים. תרכובות לשנות את מאפייני bilayer צפויים לשנות חלבון קרום לתפקד באופן עקיף, ספציפי, אולי תורם &quot;מחוץ היעד&quot; השפעות התרופה. Assay מנצל את כוחו של ערוצי gramicidin כמו בדיקות לשינויים המ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ANTS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gramicidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Chemical Co</td>
<td>G-5002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850398C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini-Extruder kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PD-10 Desalting column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare</td>
<td>54805</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties

תרופות רבות מולקולות קטנות אחרות נהגו לווסת את הפונקציה הביולוגית הם amphiphiles כי לספוג בממשק bilayer / הפתרון ובכך לשנות את מאפייני bilayer השומנים. זה חשוב כי חלבונים בממברנה הם מצמידים במרץ bilayer המארח שלהם על ידי אינטראקציות הידרופוביות. שינויים במאפייני bilayer ובכך לשנות את חלבון קרום פונקציה, אשר מספק דרך עקיפה amphiphiles לווסת את תפקוד החלבון ומנגנון אפשרי &quot;מחוץ היעד&quot; השפעות התרופה. פיתחנו בעבר assay אלקטרו לאיתור שינויים במאפייני bilayer השומנים באמצעות ערוצים gramicidin ליניארי כמו בדיקות 3,12. ערוצי Gramicidin הם מיני חלבונים שהוקמה על ידי dimerization transbilayer של שתי יחידות משנה שאינם מנהלים. הם רגישים לשינויים בסביבה הממברנה שלהם, מה שהופך אותם בדיקות עוצמה עבור ניטור שינויים במאפייני bilayer שומנים כמו חש ידי חלבונים bilayer פורש. אנחנו עכשיו להפגין assay הקרינה לאיתור שינויים במאפייני bilayer באמצעות אותם ערוצי בדיקות. Assay מבוססת על מדידת זמן מהלך מרווה פלואורסצנציה מ fluorophore טעון שלפוחית ​​unilamellar גדול בשל כניסתם של מרווה בצינורות gramicidin. אנו משתמשים זוג הקרינה אינדיקטור / מרווה 8-aminonaphthalene-1-,3,6 trisulfonate (נמלים) / טי + כי שימש בהצלחה אחרות מבחני מרווה פלואורסצנציה 5,13. טי + מחלחלת לאט bilayer השומנים 8 אך עובר בקלות דרך מנהל ערוצי gramicidin 1,14. השיטה היא מדרגי מתאים גם מחקרים מכניסטית תפוקה גבוהה ההקרנה של מולקולות קטנות עבור מביך-bilayer, ואת הפוטנציאל &quot;מחוץ היעד&quot;, אפקטים. אנו מוצאים כי התוצאות בשיטה זו הן בהסכם טוב עם תוצאות אלקטרו הקודם 12.

Watch this Scientific Journal Video about Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties at JoVE.com

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

אנחנו מציגים את assay מהיר הקרינה מבוססי המנטרת את קצב מרווה פלואורסצנציה כמדד לפעילות ערוץ gramicidin. ערוצי gramicidin משמשים מתמרים כוח מולקולרית כדי לעקוב אחר שינויים במאפייני bilayer שומנים כמו חש ידי חלבונים bilayer פורש.

Gramicidin מבוססי Assay פלואורסצנטי; לקביעת מולקולות קטנות פוטנציאל שינוי מאפייני bilayer ליפידים

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

gramicidin-based-fluorescence-assay-for-determining-small-molecules

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  Weill Cornell Medical College. אנחנו מציגים את assay מהיר הקרינה מבוססי המנטרת את קצב מרווה פלואורסצנציה כמדד לפעילות ערוץ gramicidin. ערוצי gramicidin משמשים מתמרים כוח מולקולרית כדי לעקוב אחר שינויים במאפייני bilayer שומנים כמו חש ידי חלבונים bilayer פורש.

Video: Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

דור מצע לEndonucleases של מערכות CRISPR / קאש

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

ממברנות שומנים דו-שכבתיות קשורות לניטור העברת חום בין חלקיקי זהב וממברנות שומנים

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In addition, autofluorescence attributed to chlorophyll hampers the observation of fluorescent proteins in plants. For a long time, various clearing reagents have been used to make plants transparent. However, conventional clearing reagents diminish fluorescent signals; therefore, it has not been possible to observe the cellular and intracellular structures with fluorescent proteins. Reagents were developed that can clear plant tissues by removing chlorophyll while maintaining fluorescent protein stability. A detailed protocol is provided here for the optical clearing of plant tissues using clearing reagents, ClearSee (CS) or ClearSeeAlpha (CSA). The preparation of cleared plant tissues involves three steps: fixation, washing, and clearing. Fixation is a crucial step in maintaining the cellular structures and intracellular stability of fluorescent proteins. The incubation time for clearing depends on the tissue type and species. In Arabidopsis thaliana, the time required for clearing with CS was 4 days for leaves and roots, 7 days for seedlings, and 1 month for pistils. CS also required a relatively short time of 4 days to make the gametophytic leaves of Physcomitrium patens transparent. In contrast, pistils in tobacco and torenia produced brown pigment due to oxidation during CS treatment. CSA reduced the brown pigment by preventing oxidation and could make tobacco and torenia pistils transparent, although it took a relatively long time (1 or 2 months). CS and CSA were also compatible with staining using chemical dyes, such as DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and Hoechst 33342 for DNA and Calcofluor White, SR2200, and Direct Red 23 for the cell wall. This method can be useful for whole-plant imaging to reveal intact morphology, developmental processes, plant-microbe interactions, and nematode infections.

Here, a method is described for making plant tissues transparent while maintaining the stability of fluorescent proteins. This technique facilitates deep imaging of cleared plant tissues without physical sectioning.

ניקוי אופטי של רקמות צמחים להדמיית פלואורסצנטיות

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...