Damos las gracias a Michael J. Bruno, Rusinova Radda y Jon T. saco de muchas discusiones estimulantes. El apoyo financiero del NIH, R01GM021342 y complementar ARRA R01GM021342-35S1, y la Josiah Macy Jr. Foundation para OSA, el Tri-I CMB programa de HII, y El Iris L. y S. Woodworth Leverett Médico Científico de becas y subvención del NIH MSTP GM07739 de RK.

1. Generar HORMIGAS lleno de liposomas <ol><li> El día 1, eliminar el disolvente orgánico a partir de lípidos. </li><li> Eliminar los lípidos del congelador y dejar que alcancen la temperatura ambiente. </li><li> Añadir 0,6 ml de 25 mg / ml (1,2-dierucoyl-sn-glicero-3-fosfocolina) de lípidos en solución de cloroformo a un matraz de fondo redondo de 25 ml. </li><li> Continuamente girar el matraz durante el secado en atmósfera de nitrógeno, hasta que todo el cloroformo se ha evaporado y una fina capa blanca de las capas de lípidos toda la mitad inferior de la botella. </li><li> Seca en un desecador al vacío durante la noche. </li></ol><ol><li> El día 2, preparar la muestra con el fluoróforo que se incorporarán en las vesículas. </li><li> Rehidratar en 100 mM NaNO 3, 25 mM HORMIGAS (sal Na), HEPES 10 mM. Use HNO 3 o NaOH para ajustar el pH a 7.0. Cada molécula de hormigas tiene 2 + Na, para un total de 150 mM [Na +]. Añadir 1,671 ml de electrolito para obtener una suspensión mM de lípidos 10. </li><li> Parafilm y agitar la suspensión a fondo. </li><li> Proteger la muestra de la luz con papel aluminio y dejar que la edad a temperatura ambiente durante la noche. </li></ol><ol><li> El día 3, hacer grandes vesículas unilamelares y eliminar todos los fluoróforo de fuera de las vesículas. </li><li> Someter a ultrasonidos durante 1 minuto en un baño de ultrasonidos de baja potencia. </li><li> De congelación y descongelación de la muestra 5.6 veces, cada vez con 5 minutos en hielo seco y 5 minutos en agua caliente (~ 50 ° C). </li><li> Extruir la suspensión de lípidos mediante un Avanti mini-extrusora. Configurar el mini-extrusora con un 0,1 micras filtro de policarbonato y apoya filtro (consulte el manual de extrusión para más detalles). Extruir la suspensión de ida y vuelta 21 veces de tal manera que la suspensión termina en la jeringa contrario. Cuando varios lotes se sacan, recuerde siempre que la carga de muestras con la misma jeringa. Durante la extrusión de la suspensión turbia lipídico inicial debe ser casi transparente (que seguirá siendo amarillo debido a la fluoróforo hormigas). Si la extrusión de repente se vuelve más fácil y menos presión es necesaria para moverse a través del filtro, el filtro puede tener roto y necesita ser reemplazado. </li><li> Quitar HORMIGAS externo mediante la ejecución de la suspensión de extrusión en una columna de desalación PD-10 mediante un protocolo de gravedad. Equilibrar la columna con 20-30 ml de Na-buffer (140 mM NaNO 3, 10 mM HEPES, pH 7,0, recuerde utilizar HNO 3 y NaOH para ajustar el pH). Añadir 1,5 ml de la suspensión de lípidos extruido a la columna y deje que se filtre pulg obtener un volumen total de la muestra de 2,5 ml mediante la adición de 1 ml de Na-buffer. Después de que el tampón se incorpore plenamente en la columna y no se está filtrando, eluir los liposomas con 3 ml de Na-buffer y recoger la muestra resultante. El resultado llena de hormigas LUV solución de reserva debe contener alrededor de los lípidos de 4-5 mm y parecen translúcidas de color blanco lechoso. Proteger la muestra de la luz con papel de aluminio. </li><li> Si la solución de reserva no se utiliza inmediatamente, almacenar a 13 ° C por un máximo de 7 días. Advertencia: no se congelan o enfriar la solución de lípidos por debajo de su líquido a temperatura de transición de fase de cristal (~ 12 ° C), ya que esto va a destruir la integridad de las vesículas y el fluoróforo se escapará. </li></ol> 2. Mezcla de fluorescencia de soluciones <ol><li> 24 horas antes de su uso, diluir los liposomas y se incuban con gramicidina (a 13 ° C). Equilibrio de gramicidina entre monocapas las vesículas lipídicas &quot;internos y externos es un proceso lento, que requiere una larga incubación. </li><li> Agite bien en vórtex las hormigas llenas de LUV solución madre como el LUVs tienen una densidad&gt; 1 g / ml y por lo tanto, los sedimentos en las soluciones. </li><li> Mezclar las hormigas llenas de LUV 1:20 acciones de Na-buffer. Mezclar todos los liposomas para su uso en un solo día de los experimentos juntos en un solo frasco para mejorar la uniformidad de la muestra. </li><li> Separar 3 / 4 de los liposomas y añadir 260 nm gramicidina previamente diluido en DMSO (500 mg / mL). </li><li> Para el restante 1 / 4 añadir el mismo volumen de DMSO (sin gramicidina) para mantener la concentración de disolvente constante en todas las muestras. </li></ol> 3. La creación del Instrumento de fluorescencia <ol><li> Nosotros usamos un Fotofísica Aplicada SX.20 flujo detenido espectrofluorómetro con control de temperatura para medir la tasa de extinción de fluorescencia. </li><li> A su vez los instrumentos de una hora de anticipación para permitir la entrada en calor. Los componentes son: informática, unidad de control electrónico, baño de agua (tanto frío y calor), el suministro de potencia de la lámpara y el tanque de nitrógeno. </li><li> Establecer las condiciones de grabación con el software Pro-Data SX. </li><li> La longitud de onda de excitación monocromador a 352 nm y aperturas de corte ancho para la excitación de 1 / 1. </li><li> Use un λ = 455 nm filtro pasa-altos para grabar la emisión. </li><li> Utilice la opción &quot;mantener la presión&quot; el establecimiento, lo que permite que el instrumento para mantener la presión de nitrógeno durante la grabación y por lo tanto evita oscilaciones de la presión (y los artefactos de grabación) durante la primera unos pocos milisegundos. </li><li> Set &quot;Time &quot;a 1 s, y&quot; Puntos &quot;en 5000. </li><li> Utilice el cuadro de repetir y ajustar el número de repeticiones, normalmente usamos 9 y 13 repeticiones para el búfer y se ejecuta extintor, respectivamente. </li><li> Baño de agua la temperatura se debe establecer en 25 ° C, la temperatura debe ser monitoreada en el software de SX. </li><li> Ajuste el volumen del disco a 120 l, lo que significa que cada vez que el instrumento funciona de una muestra, se mezcla 60 l de cada una de las dos jeringas. Con esta configuración instrumental, un volumen de 120 l da un tiempo muerto de ≈ 1,2 ms. </li><li> Ajuste la alta tensión (ganancia) en el detector de fluorescencia para la salida de las hormigas-liposoma es de alrededor de 8. Para una mezcla estándar experimental de la ganancia debe ser 400 a 420 V. Algunos medicamentos son fluorescentes, de manera que puedan saturar la señal de fluorescencia. En estos casos, la ganancia / tensión debería disminuir. </li><li> Cargue siempre la muestra fluorescente en la jeringa izquierda y buffer / extintor en la jeringa derecha. Asegúrese de que todas las muestras de fondo vórtice que contienen liposomas antes de cargar, y ser conscientes de que la LUVs con el tiempo se instalará en la jeringa. </li></ol> 4. Haciendo un experimento <ol><li> Prepare una muestra de hormigas cargadas LUVs, ya sea con solventes o compuestos, y la carga en el espectrofluorómetro, juntamente con Na-buffer o Tl-extintor (50 mM TlNO 3, 94 mM NaNO 3, 10 mM HEPES a pH 7,0). </li><li> Use 1,5 ml diluida ANTS-LUV solución, con o sin gramicidina, preparado el día anterior. </li><li> Añadir el compuesto a la concentración deseada y el disolvente para los controles. Mantener la concentración de disolvente a un mínimo y constante en todas las muestras. Las concentraciones tendrán que ser ajustados con cualquier nuevo (desconocido) compuesto para lograr la deseada dosis-respuesta. Incubar durante 10 min a 25 ° C en la oscuridad. </li><li> Vortex la LUV de la muestra y la carga en la jeringa izquierda. Cargue la Na-buffer o Tl-extintor en la jeringa derecha. </li><li> Bien eliminar las burbujas de aire de ambas muestras, empujando las jeringas de ida y vuelta. </li><li> Asegúrese de que ambas jeringas se cargan por igual antes de cerrar las válvulas. Carga desigual se traducirá en pre-mezcla de soluciones antes de llegar a la cámara de grabación. </li><li> Para la muestra de primera, registrar la fluorescencia con Na-buffer, repetir 4 veces, ajuste la alta tensión (ganancia) en caso necesario, y repetir 5 veces. </li><li> Para el resto de muestras, registro de 9 repeticiones con Na-buffer. </li><li> Vuelva a colocar la Na-buffer con el Tl-extintor y registro de 13 repeticiones. </li><li> Enjuague con agua y continuar con la siguiente muestra. Como controles se utiliza con muestras: no gramicidina y con disolventes, no gramicidina y con la máxima concentración del compuesto, tanto con gramicidina y solvente. </li></ol> 5. Análisis de datos <ol><li> Transferir los resultados a la computadora de análisis. Leer todos los datos en MATLAB para el análisis. Para cada muestra, lea en todos los buffer y repite extintor, con exclusión de los primeros cuatro en cada caso, como los que contienen artefactos de mezcla. Asumiendo un volumen de disco de 120 l que se necesita un poco menos de cuatro disparos para despejar completamente la mezcla anterior de la tubería de flujo detenido. </li><li> Se repite el buffer para todas las muestras deben ser muy similares. Si hay un cambio significativo en la señal de fluorescencia, que depende de la concentración del compuesto, el compuesto en sí puede ser fluorescente y puede ser necesario para restar esta primera señal de fluorescencia extra antes de la normalización de las muestras. </li><li> Manualmente ir a través de las huellas y eliminar &quot;malo&quot;, repite: repite que contiene los picos o las desviaciones de multi-exponentiality debido a los artefactos de mezcla y / o burbujas. </li><li> Normalizar las repeticiones extintor con el valor medio a partir de las repeticiones de amortiguación para cada muestra. Combine los promedios de todas las muestras en un gráfico para la visualización. </li><li> Rastros registrados sin gramicidina todos debe ser similar y casi no muestran extinción de fluorescencia, que puede haber una lenta reducción en la señal de fluorescencia debido a la lenta fuga de Tl + a través de la bicapa de vesículas 8. Si la muestra, sin gramicidina y modificador de extinción si no se presenta importantes, a continuación, las vesículas se han deteriorado y no debe usarse más. Si las muestras sin gramicidina, pero con el modificador mostrar enfriamiento significativo, entonces el modificador perturba la bicapa de vesículas de tal manera que permite que el fluoróforo o extintor para cruzar la bicapa. </li><li> Si el compuesto altera las propiedades de bicapa lipídica, detectada por los canales de gramicidina, el curso temporal de fluorescencia se visiblemente alterado. </li><li> Para cada muestra, se extendía una exponencial <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg1.jpg" alt="La ecuación 1" /> por ejemplo, 4) es apto para el primer 200-100 m de la curva de enfriamiento normalizado fluorescencia de las repeticiones individuales y la tasa de <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg2.jpg" alt="Figura 2" /> 4calculado en 2 ms. Medias y desviaciones estándar se calculan para una muestra dada de todas las repeticiones individuales. </li><li> Por último, determinar el cambio relativo en la tasa de enfriamiento por la normalización de la muestra más cercana de control en el tiempo que ha gramicidina y modificador no. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Los puntos esenciales de la fluorescencia apagar basado en análisis para detectar cambios en las propiedades bicapa lipídica Arriba a la izquierda:. Un zoom-in en una vesícula lipídica solo con las hormigas más NaNO 3 en el interior y NaNO 3, además de TlNO 3 en el exterior. Arriba a la derecha: La señal de fluorescencia grabado con (formulario de arriba a abajo) HORMIGAS vesículas llenas sin extintor, con extintor, extintor y con pre-dopado con 87, 260 y 780 nM gramicidina. Abajo: Representación esquemática de la cámara de mezcla de flujo detenido. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Una captura de pantalla del software Pro-SX datos que ilustran los distintos grupos de referencia en la descripción de la configuración experimental. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3:. Determinaciones múltiple repetición de la señal de fluorescencia de las hormigas cargadas LUVs con Na-buffer Las primeras cuatro se repite, siempre se excluyen, ya que contienen artefactos de mezcla. El tubo de conexión de las jeringas de la muestra a la celda de mezcla tiene un volumen definido, por lo tanto, las repeticiones primeras nos dará una lectura de lo que estaba previamente en el tubo: agua para repetir 1 y 2, una combinación de agua y la muestra para la repetición de 3, la mayoría de la muestra para repetir 4, y muestra sólo para el resto repite. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4:. Determinaciones múltiple repetición de la señal de fluorescencia de las hormigas cargadas LUVs con Na-buffer y con Tl-extintor Los primeros cuatro repeticiones se han eliminado de ambas condiciones. Además, para las mediciones de TI, extintor, repita 8 debe ser eliminado debido a los artefactos, las burbujas de aire más probable. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig5.jpg" alt="Figura 5" /> . Figura 5: Efecto de la capsaicina (Cap) en el transcurso del tiempo de la extinción de fluorescencia HORMIGAS (A) de la señal de fluorescencia normalizada más de 1 s, puntos grises indican los resultados de todas las repeticiones (n&gt; 5 por condición); líneas rojas indican el promedio de todos repite. (B) Los primeros 100 ms, puntos grises indican los resultados de una sola repetición para cada condición, las líneas rojas se extienden ajuste exponencial (2 - 100 ms) a los que se repite. La línea azul punteada indica la marca de 2 ms, el tiempo en que se determina la tasa de extinción. En tanto A como B y la traza de arriba muestra los resultados en la ausencia de Tl +, en los próximos dos huellas mostrar resultados en la ausencia de GA, con Tl + Cap ±; las cuatro huellas inferiores muestran los resultados con 260 nM y gA + TI, donde los números indican [PAC] en M. Las tasas de extinción de Cap M 0, 10, 30 y 90, según lo determinado por la velocidad de una estirada exponencial, de 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 y 247 ± 27 (media ± DE, n&gt; 8) , respectivamente.

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Una solicitud de patente provisional que cubre los métodos descritos en el manuscrito se ha presentado. El co-inventores son HII y OSA.

Hemos demostrado una rápida basada en fluorescencia de ensayo para determinar el potencial de doble capa modificación de las drogas y otros anfifilos pequeños. Los compuestos que modifican las propiedades de dos capas es probable que alteran la función de proteínas de membrana de una manera indirecta, no específica, que podría contribuir a &quot;fuera de objetivo&quot; efectos de los medicamentos. El ensayo explota el poder de los canales de gramicidina como sondas para cambios en las propiedades de dos capas <su...

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		<tr>
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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ANTS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gramicidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Chemical Co</td>
<td>G-5002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850398C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini-Extruder kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PD-10 Desalting column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare</td>
<td>54805</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties

Muchos fármacos y otras moléculas pequeñas que se utilizan para modular la función biológica se anfifilos que adsorben en la interfase de dos capas / solución y por lo tanto alterar las propiedades de bicapa lipídica. Esto es importante porque las proteínas de membrana son energéticamente, junto a sus dos capas de acogida por interacciones hidrofóbicas. Cambios en las propiedades de dos capas por lo tanto alterar la función de proteínas de membrana, que proporciona una forma indirecta de anfifilos para modular la función de proteínas y un posible mecanismo para &quot;fuera de objetivo&quot; efectos de los medicamentos. Anteriormente hemos desarrollado un ensayo electrofisiológico para detectar cambios en las propiedades bicapa lipídica con canales lineales gramicidina como sondas 3,12. Los canales de gramicidina son mini-proteínas formadas por la dimerización transbilayer de dos organizaciones no-realización de las subunidades. Son sensibles a los cambios en su entorno de membrana, lo que las hace las sondas de gran alcance para vigilar los cambios en las propiedades de bicapa lipídica detectada por las proteínas de dos capas de expansión. Ahora demuestran un ensayo de fluorescencia para la detección de cambios en las propiedades de dos capas utilizando los mismos canales que las sondas. El ensayo se basa en la medición del tiempo-por supuesto de extinción de fluorescencia de fluoróforo cargado vesículas unilamelares grandes debido a la entrada de un extintor a través de los canales de gramicidina. Usamos la fluorescencia indicador / extintor par de 8 aminonaftaleno-1 ,3,6-trisulfonato (hormigas) / Tl + que ha sido utilizado con éxito en otros ensayos de extinción de fluorescencia 5,13. Tl + impregna la bicapa lipídica lentamente 8, pero pasa fácilmente a través de la realización de canales de gramicidina 1,14. El método es escalable y adecuado tanto para estudios de mecánica y de alto rendimiento de detección de pequeñas moléculas de doble capa-perturbadora, y su potencial &quot;en blanco&quot;, los efectos. Nos encontramos con que los resultados con este método se encuentran en buen acuerdo con los anteriores resultados electrofisiológicos 12.

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Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Se introduce una rápida basada en fluorescencia ensayo que controla la tasa de extinción de fluorescencia como una medida de la actividad del canal gramicidina. Los canales de gramicidina se utilizan como sensores de fuerza molecular para monitorear los cambios en las propiedades de bicapa lipídica detectada por las proteínas de dos capas de expansión.

Gramicidina basado en ensayo de fluorescencia, para la determinación de moléculas pequeñas posibles para modificar las propiedades bicapa lipídica

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

gramicidin-based-fluorescence-assay-for-determining-small-molecules

Research

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Biology

12.7K vistas.  Weill Cornell Medical College. Se introduce una rápida basada en fluorescencia ensayo que controla la tasa de extinción de fluorescencia como una medida de la actividad del canal gramicidina. Los canales de gramicidina se utilizan como sensores de fuerza molecular para monitorear los cambios en las propiedades de bicapa lipídica detectada por las proteínas de dos capas de expansión.

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Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

Aplicación de un ensayo de C. elegans la degeneración neuronal de dopamina para la validación del potencial de la enfermedad de Parkinson genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Investigación

Biología

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Métodos de una sola molécula para vigilar los cambios en las propiedades elásticas bicapa

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Sustrato Generación para endonucleasas de CRISPR / Cas Sistemas

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Ligadura Altamente Eficiente de los Pequeños ARN moléculas de microARN cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

La determinación de la proteína de membrana de topología usando fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

Membranas lipídicas bicapa atadas para monitorear la transferencia de calor entre las nanopartículas de oro y las membranas lipídicas

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In addition, autofluorescence attributed to chlorophyll hampers the observation of fluorescent proteins in plants. For a long time, various clearing reagents have been used to make plants transparent. However, conventional clearing reagents diminish fluorescent signals; therefore, it has not been possible to observe the cellular and intracellular structures with fluorescent proteins. Reagents were developed that can clear plant tissues by removing chlorophyll while maintaining fluorescent protein stability. A detailed protocol is provided here for the optical clearing of plant tissues using clearing reagents, ClearSee (CS) or ClearSeeAlpha (CSA). The preparation of cleared plant tissues involves three steps: fixation, washing, and clearing. Fixation is a crucial step in maintaining the cellular structures and intracellular stability of fluorescent proteins. The incubation time for clearing depends on the tissue type and species. In Arabidopsis thaliana, the time required for clearing with CS was 4 days for leaves and roots, 7 days for seedlings, and 1 month for pistils. CS also required a relatively short time of 4 days to make the gametophytic leaves of Physcomitrium patens transparent. In contrast, pistils in tobacco and torenia produced brown pigment due to oxidation during CS treatment. CSA reduced the brown pigment by preventing oxidation and could make tobacco and torenia pistils transparent, although it took a relatively long time (1 or 2 months). CS and CSA were also compatible with staining using chemical dyes, such as DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and Hoechst 33342 for DNA and Calcofluor White, SR2200, and Direct Red 23 for the cell wall. This method can be useful for whole-plant imaging to reveal intact morphology, developmental processes, plant-microbe interactions, and nematode infections.

Here, a method is described for making plant tissues transparent while maintaining the stability of fluorescent proteins. This technique facilitates deep imaging of cleared plant tissues without physical sectioning.

Limpieza óptica de tejidos vegetales para imágenes de fluorescencia

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...