우리는 많은 자극 토론 마이클 J. 브루노, Radda Rusinova와 존 T. 색 감사합니다. NIH, R01GM021342와 아라 보완 R01GM021342 - 35S1, 그리고 OSA에 요시야 메이시, 주니어 재단에서 재정 지원, 트라이 - I HII위한 CMB 프로그램, 그리고 아이리스 L. 및 리버렛 S. 워스 의료 과학 원정대와 NIH MSTP 부여 RK위한 GM07739.

1. 개미 채워진 Liposomes를 생성 <ol><li> 1 일에, lipids에서 용매 유기를 제거합니다. </li><li> 냉동실에서 지방질을 제거하고 실내 온도 평형하자. </li><li> 25 MG / ML의 0.6 ML (1,2 - dierucoyl - SN - glycero - 3 - phosphocholine) 25 ML 라운드 바텀 플라스크에 클로로포름 용액에 지방질을 추가합니다. </li><li> 모든 클로로포름이 증발 및 지질 코팅 술병의 전체 아래쪽의 얇은 흰색 필름 때까지, 질소 하에서 건조하는 동안 지속적으로 휴대용 술병을 돌린다. </li><li> 하룻밤 진공 아래 dessicator에서 건조. </li></ol><ol><li> 일 2, vesicles에 통합 될 형광단와 샘플을 준비합니다. </li><li> 100 MM 나노 3, 25 MM 개미 (나 소금), 10 MM HEPES에 Rehydrate. 7.0 산도를 조정하는 HNO 3 NaOH를 사용합니다. 각각의 개미 분자 150 MM 총 2 나 +를 가지고 [나 +]. 10 MM의 지질 정지를 얻을 전해액의 1.671 ML을 추가합니다. </li><li> 철저하게 Parafilm 및 와동 정지. </li><li> 호일로 빛을에서 샘플을 보호하고 하룻밤 실온에서 나이를 보자. </li></ol><ol><li> 3 일에, 대형 unilamellar vesicles를 만들어 vesicles 외부에서 모두 형광단를 제거합니다. </li><li> 저전력 sonicator 1 분 Sonicate. </li><li> 동결 - 해동 샘플 5-6 시간, 드라이 아이스에 5 분, 따뜻한 (~ 50 ° C) 물에 5 분마다. </li><li> 아반티 미니 압출기를 사용하여 지질 현탁액을 돌출. 0.1 μm의 폴리 카보 네이트 필터 및 필터 지원 (자세한 내용은 압출기 설명서를 참조) 미니 압출기를 설정합니다. 앞뒤 정지가 반대 주사기에 끝이 같은 21 번 정학을 돌출. 여러 배치가 압출 때, 항상 같은 주사기로 샘플을로드해야합니다. 압출 동안 흐린 초기 지질 서스펜션은 (아직 인해 개미의 형광단에 노란색됩니다) 거의 반투명 될 것입니다. 압출 갑자기 쉽게되고 낮은 압력이 필터를 통해 이동하는 데 필요한 경우, 필터는 파열있을 수 및 교체해야합니다. </li><li> 중력 프로토콜을 사용 PD - 10 탈염 칼럼을 통해 압출 정지를 실행하여 외부 개미를 제거합니다. 나 - 버퍼의 20-30 ML와 열 평형 (140 MM 나노 3, 10 MM HEPES, pH를 7.0, 산도를 조정하는 HNO 3 NaOH를 사용해야합니다.) 그 결과 해당 컬럼에 대한 압출 지질 정지의 1.5 ML를 추가하고 1 ML 나 버퍼를 추가하여 2.5 ML 샘플의 전체 볼륨을 가지고 인치 침투하자. 버퍼가 완전히 열에 통합되고 아무것도 밖으로 누출되지 않습니다 후에 나 - 버퍼 3 ML과 liposomes을 elute 및 결과 샘플을 수집합니다. 채워진 결과 개미 주식 솔루션 4-5 MM의 lipids에 대한 포함하고 반투명 유백 색의 흰색 나타납니다 LUV. 호일과 빛의에서 샘플을 보호합니다. </li><li> 13 주식 솔루션은 즉시 사용하지 않을 경우, 저장 ° 칠일의 최대 C. 경고 : 고정 또는 크리스탈 상 전이 온도 (~ 12 ° C),이 vesicles &#39;무결성을 파괴하고 형광단가 누출되므로 액체 아래 지질 솔루션을 냉각하지 않습니다. </li></ol> 2. 믹스 형광 솔루션 <ol><li> 24 시간 전에 사용 liposomes를 희석하여 (13 ° C에서) 그램이시딘와 부화. 지질 vesicles &#39;내부와 외부 monolayers 사이 그램이시딘의 평균은 긴 부화가 필요 느린 과정이다. </li><li> 철저하게 와동 LUVs가 밀도&gt; 1 G / ML이 같은 재고 솔루션을 LUV 개미 가득한 것이고, 따라서 침전 솔루션 인치 </li><li> 믹스 개미 - 채워진 나 버퍼의 재고 1시 20분를 LUV. 샘플 균일성 향상을위한 하나의 플라스크에서 함께 실험 중 하나가 하루에 사용하는 모든 liposomes를 섞습니다. </li><li> liposomes 3 / 4 밖으로 분리하고 260 nm의 그램이시딘 DMSO에 미리 희석을 (500 μg / ML)을 추가합니다. </li><li> 하기 위해 1 / 4 모든 샘플의 용매 농도가 일정하게 유지하는 DMSO의 동일한 음량을 (그램이시딘없이) 추가 남아 있습니다. </li></ol> 3. 형광 악기 설정 <ol><li> 우리는 형광 담금질의 속도를 측정하기 위해 온도 제어 응용 Photophysics SX.20 중지 흐름 spectrofluorometer를 사용합니다. </li><li> 따뜻한 최대 허용 미리 시간에 악기를 켭니다. 구성 요소는 다음과 같습니다 컴퓨터, 전자 제어 장치, 물 욕조 (쿨러 및 히터 모두), 램프 전원 공급 장치 및 질소 탱크. </li><li> 프로 데이터 SX 소프트웨어를 사용하여 녹음 조건을 설정합니다. </li><li> 여기 일분의 일 수있는 단색의 여기 파장 352 nm의 및 슬릿 폭 apertures로 설정합니다. </li><li> 방출을 기록하기 = 455 nm의 높은 패스 필터 λ를 사용하십시오. </li><li> 녹음 중에 질소 압력을 유지하기 위해 악기를 가능하게하기 때문에 처음 몇 밀리초 동안 압력 oscillations (및 녹화 유물)를 방지 &quot;압력 대기&quot;설정을 사용합니다. </li><li> &quot;티 세트나에게 5000 포인트 &quot;&quot;1 S하고. &quot; </li><li> 반복 상자를 사용하여 반복의 수를 조정, 일반적으로 우리가 각각 버퍼와 끄는 프로그램 실행 9 13 반복을 사용합니다. </li><li> 물 목욕 온도가 25로 설정되어야 ° C; 온도 SX 소프트웨어에서 모니터해야합니다. </li><li> 때마다 악기, 샘플을 실행 그것이 두 개의 주사기 각 60 μL를 혼합 즉, 120 μL에 드라이브 볼륨을 설정합니다. 이 기기 설치와 함께, 120 μL 볼륨 ≈ 1.2 MS의 죽은 시간을 제공합니다. </li><li> 8 시경으로 개미 - 리포좀의 출력에 대한 형광 검출기에 고전압 (게인)을 조정합니다. 표준 실험 혼합물에 대한 이득은 400-420해야 V. 마약은 형광 그들이 형광 신호를 포화 수와 같은 수 있습니다. 이러한 경우에는 게인 / 전압은 감소한다. </li><li> 항상 오른쪽 주사기의 왼쪽 주사기 및 버퍼 / 끄는에 형광 샘플을로드합니다. 철저하게 와동에 있는지 확인합니다 모든 로딩하기 전에 liposomes가 포함된 샘플, 시간과 LUVs가 주사기에 정착됩니다 점에 유의하십시오. </li></ol> 4. 실험을하는 <ol><li> 와 개미 - 로드된 LUVs의 샘플을 준비 나 버퍼 또는 TL - 끄는 (50 MM TlNO 3, 94 MM 나노 3, 산도 7.0 10 MM HEPES) 중 하나와 함께 spectrofluorometer에 용매 또는 화합물, 그리고 부하 ​​중 하나. </li><li> 1.5 ML 희석 사용 또는 그램이시딘없이 솔루션을 개미가 - LUV 전날 준비. </li><li> 원하는 농도의 화합물 또는 컨트롤에 대한 용매를 추가합니다. 모든 샘플에 걸쳐 최소 및 상수에 용매 농도를 유지. 농도 원하는 복용량 - 반응 범위를 달성하기 위해 새로운 (알 수 없음) 화합물로 조정해야합니다. 25 10 분 품어 ° C를 어둠에 약해. </li><li> 와동이 샘플을 LUV하고 왼쪽 주사기로로드합니다. 오른쪽 주사기로 나 버퍼 또는 TL - 끄는를로드합니다. </li><li> 철저하게 앞뒤로 주사기를 밀어 두 샘플에서 기포를 제거합니다. </li><li> 두 주사기가 밸브를 닫기 전에 마찬가지로로드되어 있는지 확인하십시오. 그들은 기록 챔버에 도달하기 전에 등한 로딩이 솔루션 미리 혼합 발생합니다. </li><li> 처음 샘플 들어, 나 버퍼로 형광을 기록 4 번 반복 필요한 높은 전압 (게인)을 조정하고, 5 번 반복합니다. </li><li> 나 - 버퍼 나머지 샘플, 기록 구 반복하십시오. </li><li> TL - 끄는 및 기록 13 반복과 나 버퍼를 교체하십시오. </li><li> 물로 씻어 다음 예제를 계속합니다. 용매와도 그램이시딘하고, 최대 화합물 농도와 노 그램이시딘과를 그램이시딘 및 용매 모두 : 우리가 샘플을 사용하지 컨트롤로. </li></ol> 5. 분석 데이터 <ol><li> 분석 컴퓨터에 결과를 전송합니다. 분석을위한 MATLAB으로 모든 데이터를 읽습니다. 이들은 혼합 유물을 포함하는 각 샘플의 경우, 각각의 경우에 처음 네 제외한 모든 버퍼와 끄는 반복에 참조하십시오. 그것이 완전히 정지 흐름 튜브에서 이전 혼합물을 취소하고 좀 덜보다 4 샷을 소요 120 μL의 드라이브 볼륨을 가정. </li><li> 모든 샘플에 대한 버퍼 반복은 매우 유사합니다. 화합물 농도에 따라 형광 신호에 상당한 변화가있다면 다음 화합물 자체는 형광 수 있으며 먼저 샘플을 정규화하기 전에 여분의 형광 신호를 뺄 필요가있을 수도 있습니다. </li><li> 수동으로 흔적을 통해 이동하여 &quot;나쁜&quot;반복 제거 : 혼합 유물 및 / 또는 거품에 의한 다중 exponentiality에서 스파이크 또는 편차를 포함하는 반복합니다. </li><li> 각 샘플에 대한 버퍼 반복의 평균 시작 값으로 끄는 반복을 정상화. 시각화를 하나의 그래프로 모든 샘플의 평균을 결합합니다. </li><li> 노 그램이시딘로 기록된 흔적은 유사하고 거의 형광 담금질을 보여주지해야한다 TL의 누출을 늦추기 위해 + vesicles 이중층 8 의한 형광 신호의 속도 감소가있을 수 있습니다. 노 그램이시딘없이 수정자와 함께 샘플 상당한 담금질가 표시되면 다음 vesicles이 악화하고 더 이상 사용할 수 없습니다. 노 그램이시딘로하지만 수정자와 샘플이 중요한 담금질을 보여주면, 수정자는 형광단이나 빛 따위를 끄는가 이중층를 건너 수 있습니다 그러한 정도로 vesicles의 이중층을 perturbs. </li><li> 화합물은 지질 이중층의 속성을 바꿀지도 모르겠어 경우로 그램이시딘 채널에 의해 감지, 형광 시간 과정은 가시 변경됩니다. </li><li> 각 샘플의 경우, 뻗어 지수 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg1.jpg" alt="방정식 1" /> 예 4) 각 반복의 표준 형광 담금질 곡선의 첫 번째 2-100 MS와 속도에 맞는 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg2.jpg" alt="그림 2" /> 4이 MS에서 계산. 평균 및 표준 편차는 모두 각각의 반복에서 주어진 시료에 대해 계산됩니다. </li><li> 마지막으로, 그램이시딘없이 수정자를 가지고 시간에 가장 가까운 제어 샘플을 정규화하여 담금질 속도의 상대적인 변화를 결정합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : 형광 담금질 기반 분석의 요점은 지질 이중층 특성의 변화를 감지하기 위해 왼쪽 상단 :. 확대의 내부와 밖에서 나노 3 + TlNO 3 개미 플러스 나노 3 단일 지질 소포에. 오른쪽 상단 : 끄는 및 87, 260 및 780 나노미터 그램이시딘으로 미리 도핑된와 끄는 함께 끄는없이 (위에서 아래 양식) 개미 - 채워진 vesicles를 사용하여 기록 형광 신호. 하단 : 정지 흐름 혼합 챔버의 도식 표현. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 : 실험 설정의 설명에 언급된 다양한 패널을 보여주는 프로 데이터 SX 소프트웨어의 스크린 샷을. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3 :.들이 혼합 유물을 포함하는 등 나 버퍼와 개미 -로드 LUVs에서 형광 신호의 여러 반복 결정은 처음 네 반복은 항상 제외됩니다. 혼합 세포에 샘플 주사기를 연결하는 튜브는 정의된 볼륨을 가지고, 따라서 처음 몇 반복은 우리에게 튜브 이전에 있었는지의 독서를 줄 것이다 : 물을 반복 1과 2를 반복합니다 3 물 샘플의 일부 조합에 대한 나머지 반복을위한 반복 4 단 샘플에 대한 대부분 샘플. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4 :. 나 버퍼과 TL - 끄는와 개미 -로드 LUVs에서 형광 신호의 여러 반복 결정은 처음 네 반복이 두 조건에서 삭제되었습니다. 또한, TL - 끄는 측정, 유물, 가능성이 가장 높은 기포로 인해 제거 8 요구를 반복합니다. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig5.jpg" alt="그림 5" /> . 그림 5 : 개미 형광 담금질의 시간 코스에 capsaicin (CAP)의 효과 (1) S 이상의 표준화 형광 신호, 회색 점들은 모든 반복 (N&gt; 5 조건 당)의 결과를 나타내는, 빨간색 라인은 모두의 평균을 나타냅니다 반복합니다. (B) 처음 100 MS는 회색 점들은 각 조건에 대한 단일 반복의 결과를 나타내는, 빨간색 라인은 지수 맞는 (2-100 MS) 늘어 이들 반복을합니다. stippled 파란색 라인은 2 MS 마크 담금질의 속도가 결정됩니다되는 시간을 나타냅니다. A와 B 모두에서 최고의 추적 TL이없는 결과를 보여줍니다 +; 다음 두 자취는 TL과 함께, GA의 부재에서 결과를 표시 + ± 모자, 네 개의 낮은 흔적은 260 nm의 GA 및 TL +, 어디로 결과를 표시 번호 μm의의 [모자]를 상징. 로 늘어 지수의 속도에 의해 결정 0, 10, 30 90 μm의 모자, 위해 담금질의 가격 36아르 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 247 ± 27 (± SD, N&gt; 8을 의미) 각각.

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원고에 설명되어있는 방법을 다루고 임시 특허 신청이 접수되었습니다. 공동 발명가는 HII 및 OSA 있습니다.

우리는 마약과 기타 소형 amphiphiles의 이중층 수정 가능성을 판단하는 빠른 형광 기반의 분석을 증명하고있다. 이중층의 속성을 수정 화합물 가능성이 &quot;오프 대상&quot;약물 효과에 기여, 간접, 특이 현상이 방식으로 막 단백질 기능을 변경할 수있다. 분석은 이중층 - 스패닝 단백질에 의해 감지 아르 이중층 등록 정보의 변경 12 프로브로 그램이시딘 채널의 전원을 이용. 형광 기반의 분?...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ANTS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gramicidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Chemical Co</td>
<td>G-5002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850398C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini-Extruder kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PD-10 Desalting column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare</td>
<td>54805</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties

생물 학적 기능을 조절하는 데 사용되는 많은 약물 및 다른 작은 분자는 이중층 / 솔루션 인터페이스에서, 따라서 adsorb은 지질 이중층의 속성을 변경되는 amphiphiles 있습니다. 막 단백질은 소수성 상호 작용을 정력적으로 자신의 호스트 이중층에 결합되기 때문에 이것은 중요합니다. 이중층 등록 정보에 변경 따라서 단백질 기능 및 &quot;오프 대상&quot;약물 효과에 대한 가능한 메커니즘을 조절하는 amphiphiles에 대한 간접적인 방법을 제공 막 단백질 기능을 변경할 수 있습니다. 우리는 이전에 프로브 3,12과 같은 선형 그램이시딘 채널을 사용하여 지질 이중층 등록 정보에서 변경을 검출 electrophysiological 분석을 개발했습니다. 그램이시딘 채널은 두 아닌 수행 subunits의 transbilayer dimerization에 의해 형성 미니 단백질입니다. 그들은 지질 이중층 등록 정보 모니터링 변화를위한 강력한 프로브과 같이 이중층 스패닝 단백질에 의해 감지하게 자신의 멤브레인 환경의 변화에​​ 민감합니다. 우리는 지금 프로브와 같은 채널을 사용하여 이중층 속성의 변화를 검출 형광 분석을 보여줍니다. 분석은 그램이시딘 채널을 통해 끄는의 항목으로 인해 형광단 - 로드된 대형 unilamellar vesicles에서 형광의 담금질의 시간 코스를 측정을 기반으로합니다. 우리는 형광 표시 / 빛 따위를 끄는 쌍을 사용하여 8 aminonaphthalene - 1 ,3,6 - trisulfonate (개미) / TL + 성공적으로 다른 형광 담금질의 assays 5,13에서 사용되었는지. TL + 천천히 8 지질 이중층을 permeates하지만 그램이시딘 채널 1,14를 실시를 통해 쉽게 전달합니다. 방법은 기계론의 연구와 이중층 - perturbing하고, 잠재적인 &quot;오프 대상&quot;효과에 대한 작은 분자의 높은 처리량 검사를 모두 확장하고 적합합니다. 우리는이 방법을 사용하여 결과를 이전 electrophysiological 결과 12 좋은 계약에다는 것을 찾을 수 있습니다.

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Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

우리는 그램이시딘 채널 활동의 조치로 형광 담금질의 속도를 모니터링 빠른 형광 기반의 분석을 소개합니다. 그램이시딘 채널 지질 이중층 속성의 변화로 이중층 스패닝 단백질에 의해 감지를 모니터링하는 분자 힘 변환기로 사용됩니다.

그램이시딘 기반의 형광 분석, 지질 이중층의 속성을 수정하는 작은 분자 잠재 결정

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.7K 조회수.  Weill Cornell Medical College. 우리는 그램이시딘 채널 활동의 조치로 형광 담금질의 속도를 모니터링 빠른 형광 기반의 분석을 소개합니다. 그램이시딘 채널 지질 이중층 속성의 변화로 이중층 스패닝 단백질에 의해 감지를 모니터링하는 분자 힘 변환기로 사용됩니다.

비디오: Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

이중층 탄성 등록 정보 모니터링 변경에 대한 단일 분자 방법

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

연구

생물학

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

CRISPR / 카스 시스템의 Endonucleases을위한 기판 생성

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FP​​P)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

금 나노 입자와 지질 막 사이의 열 전달을 모니터링하는 테더링 된 바이 레이어 지질 멤브레인

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In addition, autofluorescence attributed to chlorophyll hampers the observation of fluorescent proteins in plants. For a long time, various clearing reagents have been used to make plants transparent. However, conventional clearing reagents diminish fluorescent signals; therefore, it has not been possible to observe the cellular and intracellular structures with fluorescent proteins. Reagents were developed that can clear plant tissues by removing chlorophyll while maintaining fluorescent protein stability. A detailed protocol is provided here for the optical clearing of plant tissues using clearing reagents, ClearSee (CS) or ClearSeeAlpha (CSA). The preparation of cleared plant tissues involves three steps: fixation, washing, and clearing. Fixation is a crucial step in maintaining the cellular structures and intracellular stability of fluorescent proteins. The incubation time for clearing depends on the tissue type and species. In Arabidopsis thaliana, the time required for clearing with CS was 4 days for leaves and roots, 7 days for seedlings, and 1 month for pistils. CS also required a relatively short time of 4 days to make the gametophytic leaves of Physcomitrium patens transparent. In contrast, pistils in tobacco and torenia produced brown pigment due to oxidation during CS treatment. CSA reduced the brown pigment by preventing oxidation and could make tobacco and torenia pistils transparent, although it took a relatively long time (1 or 2 months). CS and CSA were also compatible with staining using chemical dyes, such as DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and Hoechst 33342 for DNA and Calcofluor White, SR2200, and Direct Red 23 for the cell wall. This method can be useful for whole-plant imaging to reveal intact morphology, developmental processes, plant-microbe interactions, and nematode infections.

Here, a method is described for making plant tissues transparent while maintaining the stability of fluorescent proteins. This technique facilitates deep imaging of cleared plant tissues without physical sectioning.

형광 이미징을 위한 식물 조직의 광학 클리어링

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

A Fluorescence-Based Assay of Membrane Potential for High-Throughput Functional Study of Two Endogenous Ion Channels in Two Epithelial Cell Lines

Fluorescence-based studies are suitable for high-throughput plate reader assays of cells in culture. They have been commonly employed for drug discovery campaigns targeting recombinant ion channel proteins overexpressed in cells such as HEK-293 cells. However, there is increasing emphasis on the use of tissue-relevant cell lines for studying the effects of small molecule interventions. The following protocol describes the adaptation of a fluorescence-based membrane potential assay for the study of ion channels endogenously expressed in epithelial cell lines. The membrane potential assay details a high-throughput assay for chloride channel activity of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) in two commonly studied epithelial cell lines, Caco-2 and Calu-3. In addition, this paper describes a novel application of this system to measure the activity of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) in a high-throughput format in the same epithelial cell lines. Together, these fluorescence-based assays provide a robust and flexible platform for studying small molecule modulators, targeting two epithelial channels in a relevant cellular context.

This protocol describes a method for the study of electrogenic membrane proteins by measuring changes in membrane potential. This assay provides a platform for the functional readout of multiple ion channels endogenously expressed in epithelial cell lines.

두 개의 상피 세포주에서 두 개의 내인성 이온 채널에 대한 고처리량 기능 연구를 위한 막 전위의 형광 기반 분석

Fluorescence-based studies are suitable for high-throughput plate reader assays of cells in culture. They have been commonly employed for drug discovery ...