Zellzyklus-Ruhe ist ein Schlüsselmerkmal hämatopoetischer Stammzellen. Dieses Protokoll hilft, das Verhalten von stillen menschlichen HSCs in vitro unter nahezu physiologischen Bedingungen zu verstehen. Mit diesem Protokoll können Forscher die Wirkung verschiedener Verbindungen, Nährstoffe oder Proteine testen, die den Zellzyklusstatus sowie die Differenzierung von HSCs skalierbar regulieren, ohne Tiermodelle zu verwenden.
Krebsmedikamente haben unterschiedliche Auswirkungen auf das Überleben von stillen HSCs und Radsport-Vorläufern. Dieses Protokoll ermöglicht es, Wirkstoffe zu finden, die stille HSCs oder Wirkstoffe erhalten, die selektiv ruhende leukämische Stammzellen schädigen. Das Verfahren demonstriert Hiroshi Kobayashi, ein leitender Forschungsstipendiat des Takubo-Labors.
Zu Beginn lösen Sie 16 Milligramm pro Milliliter Natriumpalmitat, 30 Milligramm pro Milliliter Natriumoleat und vier Milligramm pro Milliliter Cholesterin in Methanol in Glasröhren. Bewahren Sie die Lipidlösungen bei minus 30 Grad Celsius auf und tauen Sie sie vor gebrauchen auf. Mischen Sie in einem frischen Glasrohr die Lipidlösungen, um die Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter Palmitat, 100 Mikrogramm pro Milliliter Oleat und 20 Mikrogramm pro Milliliter Cholesterin zu erhalten.
Verdampfen Sie das Methanol, indem Sie Stickstoffgas durch die Lipidlösung passieren. Das restliche Methanol vollständig verdampfen, indem man das Glasrohr in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius erhitzt. DMEM/F-12 Medium mit HEPES und Glutamin vorbereiten.
Penicillin und Streptomycinsulfat für eine Endkonzentration von 50 Einheiten bzw. 50 Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen. Das Medium kann bei vier Grad Celsius für mindestens zwei Monate gelagert werden. Fügen Sie 4% bSA zu DMEM/F-12 Medium mit HEPES und Glutamin hinzu, dann stellen Sie den pH-Wert des Mediums mit Natriumhydroxidlösung auf 7,6 ein.
Fügen Sie das Medium mit den Lipiden in das Glasrohr. Die Lipide durch Beschallung vollständig auflösen. Wenn das Medium nach der Beschallung undurchsichtig ist, verlängern Sie die Beschallungszeit.
Wenn die BSA und Lipide gelöst sind, sollten die Proben bei negativen 80 Grad Celsius gelagert und innerhalb von zwei Monaten verwendet werden. 0,001X Insulin, Transferrin, Natriumselenit und Ethanolamingemisch in das DMEM/F-12 geben und dann das Mischmedium mit einem 0,22-Mikrometer-Filter filtern. Vor der Anwendung den menschlichen Stammzellfaktor oder SCF und humanes Thrombopoietin oder TPO in einer Endkonzentration von jeweils drei Nanogramm pro Milliliter in die Kulturmedien aufnehmen.
200 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Kulturmedien mit Zytokinen auf flache 96-Well-Platten übertragen. Um eine Verdunstung des Mediums zu vermeiden, füllen Sie alle ungenutzten Brunnen mit 100 bis 200 Mikroliter PBS. Setzen Sie die sortierten hämatopoetischen Stammzellen oder HSCs in Kulturmedien ohne Zytokine bei 60 Zellen pro Mikroliter aus.
Aliquot 600 Zellen in jedem Brunnen. Weniger als 300 Zellen führen zu größeren technischen Variationen und die Kultivierung von mehr als 1 000 Zellen in einem einzigen Brunnen sollte aufgrund von Nährstoffentzug oder Anhäufung ungünstiger Zytokine oder Chemokine vermieden werden. Kultur die Zellen in einem befeuchteten Multi-Gas-Inkubator bei 37 Grad Celsius in einer 5% Kohlendioxid und 1% Sauerstoffatmosphäre.
Nach sieben Tagen kultivieren der gereinigten HSCs zeigten bis zu 80% der Zellen Marker CD34 positive und CD38 negative Phänotypen. Die Gesamtzellzahl hing von der Zytokinkonzentration ab. Höhere Konzentrationen von SCF und TPO induzierten Eintritt in den Zellzyklus, Proliferation und Differenzierung.
Die Anzahl der phänotypischen HSCs, die durch den Marker CD34 positiv, CD38-negativ, CD90-positive und CD45 RA-negative Phänotypen gekennzeichnet sind, nahm proportional zu den SCF- oder TPO-Konzentrationen zu, während die Frequenz unter den Gesamtzellen abnahm. Nach dreimonatiger Transplantation kultivierter adulter Knochenmark-HSCs kann die Rekonstitution als Funktion ihrer Häufigkeit im peripheren Blut des humanen CD45-positiven Murins, CD45-negativer Ter119-Negativzellen, bewertet werden. Drei Linel einschließlich CD19-positive B-Zellen, CD13-negativ, CD33-positive Myeloidzellen und CD3-positive T-Zellen wurden in NOG-Mäusen rekonstituiert, die entweder mit frisch aufgetauten oder kultivierten HSCs transplantiert wurden.
Im Anschluss an die Kultur können HSCs Genexpressionsprofilen wie Echtzeit-PCR und RNA-Sequenzierung unterzogen werden. Eine funktionelle Validierung durch Transplantation an immungeschwächten Mäusen kann ebenfalls durchgeführt werden. Die Forscher können Radfahr- und Ruhe-HSCs unter definierten Bedingungen direkt vergleichen, indem sie die Zytokinkonzentrationen anpassen.
Dies wird helfen, die stillen HSC-spezifischen Selbsterneuerungsprogramme, Stressresistenzmechanismen und metabolischen Eigenschaften zu verstehen, die schwer zu testen sind in vivo-Einstellungen.
