Wir bedanken uns bei Jos Burgert für die Hilfe bei einigen der Figuren. Wir danken Ingo Selbach (und der Gruppe &quot;Edelkrebsprojekt NRW&quot;) für seine Bemühungen um das Labor mit Versuchstieren zu versorgen. Wir danken Anna C. Schneider für das Korrekturlesen ersten Versionen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch ein Emmy Noether-Stipendium der DFG SM 206 / 3-1 und dem Start Gewährung der Universität zu Köln für weibliche Dozenten unterstützt.

Diese Dissektion Verfahren ist gemäß der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates vom 22. nd September 2010 (2010/63 / EU). 1. Vorbereitung <ol><li> Erhalten Krebse, Pacifastacus leniusculus (Dana), beider Geschlechter ≥8 cm groß. Stellen Sie sicher, dass die Tiere sind von entscheidender Bedeutung und den Bauch und Bauch Gliedmaßen intakt sind. </li><li> Achten Sie darauf, um den Panzer zu untersuchen und dass diese Schuppenschicht ist hart und steif. Vor- und postmolt Tiere haben einen weichen Panzer und werden, weil während der Häutungsprozess viele Parameter verändern nicht für Experimente geeignet (zB Verringerung der Bewegungsaktivität). </li><li> Montieren Sie alle Werkzeuge und Materialien während der Präparation verwendet, Pinning und desheathing der Nervenstrang in Abbildung 2 dargestellt und in den Ergänzungen geliefert wurde. </li></ol><img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: <strong&gt; Materialien und Werkzeuge für die Zerlegung verwendet, Pinning und desheathing der Nervenstrang. (1) großen Eimer mit Eis gefüllt; (2) Krebse Kochsalzlösung; (3) Kochsalzspender; (4) Dissektionsmikroskop; (5) Dissektion Gericht; (6) starke Schere; (7) Pinzetten (8) Frühling Schere; (9) Petrischale mit klaren Sylgard gesäumten; (10) Befestigungsstifte; (11) kalt Lampenquelle. 2. Brutto-Dissektion <ol><li> Anesthetize Tier auf Eis für 15 - 20 min. Führen Sie den ersten Teil des Brutto-Dissektion bei einem Labortisch in der Nähe der Spüle, da sie einen Schritt Ausbluten und die Probe muss während des Verfahrens regelmäßig mit Flusskrebsen Kochsalzlösung gespült werden. </li><li> Halten Tierbauchseite nach oben und nutzen starke Schere beide Klauen an ihren Basen in der Nähe des Brustkorbs (Abbildung 3-1) zu schneiden. Entfernen Sie links und rechts Uropod (Abbildung 3-2). </li><li> Legen Sie das Tier Bauchseite nach oben in der Dissektion Gericht mit schwarzen Sylgard ausgekleidet. Elevate Cephalothorax indem Eis unter und stecken Sie den Bauch an Telsons (4A). </li><li> Füllen Sie den Salzspender mit ~ 60 ml gekühltes Krebse Kochsalzlösung. Perfuse Krebse mit kalter Kochsalzlösung durch die Krallenöffnung (4B). Überschüssiges Salz wird durch die Einschnitte bei den Uropoden abtropfen. Bedecken Sie Krebse mit Eis während Ausbluten </li><li> Enthaupten das Tier mit einem einzigen Quer schneiden nur die Augen der Tiere mit starken Schere (5A) posterior. Entfernen Sie alle Laufbeinen in der Nähe der Grundgelenke, wie in 5B dargestellt. </li><li> Isolieren Sie den Bauch mit den letzten Thoraxsegmente vom Rest Cephalothorax. Einen ersten Schnitt in der Ebene der zweiten Schreitbeine (Brustsegment 3) durch Einführen der Spitze der Schere in die Öffnung des zweiten Schreitbein und Schneiden auf der gegenüberliegenden Seite. (6A-1). </li><li> Verlängern Sie diesen ersten Schnitt zu beiden Seiten durch ter Cephalothorax (6A-2). </li><li> Klappen Sie den Tier offen machen einige der inneren Organe sichtbar. Drücken Sie die prominente Verdauungsdrüse (6B-3) auf den vorderen Teil der Probe und verwenden Pinzette, um die Fortpflanzungsorgane aus der Bauchhöhle zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie den vorderen Teil des Cephalothorax (6C). Verwenden seitliche Schnitte, die seitlichen Teile des Panzers, die die Kiemen decken auf beiden Seiten des verbleibenden Brustkorb (6D-4) zu entfernen. Entfernen Sie die Kiemen und spülen Sie die Probe mit kaltem Salzlösung. </li><li> Weiterhin die Präparation mit einem Schnitt durch die gesamte Länge des Brustbeinplatte, wie in 6E-5 angegeben. Machen Sie diesen Schnitt bei maximaler seitlichen Positionen zwischen pleuron und swimmerets (6E rote Markierung). Gehen Sie auf der anderen Seite mit einem gleichen Schnitt. Spülen Sie die Probe mit kaltem Salzlösung. </li><li> Führen Sie die verbleibenden Dissektion unter DISSECTIOn Mikroskop. Zeigen Bauch Bauchseite der Flusskrebs ist in der Dissektion Gericht mit schwarzen Sylgard gesäumten und mit Flusskrebsen Kochsalzlösung gefüllt, so dass es die Probe umfasst. HINWEIS: In den folgenden Schritten (2,12 bis 4,8) enthalten Richtungsanweisungen, die Rechtshänder Experimentatoren anzuwenden. In den folgenden Schritten (2,12 bis 6,8) ist es wichtig, Krebse Kochsalzlösung in regelmäßigen Abständen mit kalter Kochsalzlösung zu ersetzen, alle 20-30 Minuten, um das Nervensystem gesund zu halten. </li><li> Befestigen Sie die Probe mit Insektenstifte hinten an der Telson und nach vorn auf die Überreste des Panzers. Legen Sie die Probe, so dass die telson Punkte links und parallel zu der Tischkante. </li><li> Verwenden Grobzange in der linken Hand, um durch eine Laufbeinöffnung (7A) zu packen und ziehen Sie die Probe geöffnet (7B weißer Pfeil). Identifizieren Sie die großen zwei Rückenbeugemuskelstränge (7B-1 und C-1) und schneiden ihre ventraleBasis, wie in 7B gezeigt. </li><li> Identifizieren Sie die Brustbeinschlagader (7C-2), die von Rücken (das Herz), senkt sich auf ventralen, auf der 4. Brustsegment. Diese Arterie liegt direkt über dem Nervenstrang (7C-3), bevor sie Projekte unter dem Nervenstrang und bilden die Bauchschlagader. </li><li> Durchschneiden die Brustbeinarterie. Wie in 7C gezeigt, heben Sie die Arterie ersten, mit einer Klinge der Schere, und nur unterbrochen, wenn das ventral Nervenstrang sichtbar ist. </li><li> Befestigen Sie die Rückenbeugemuskeln nach vorn (nach rechts). Dies sollte in maximal gestreckte Lage mit Stiften getan, damit sie nicht Vision zu sperren und die Probe bleibt gespannt. Wenn die Rückenmuskelstränge fixiert (Figur 8-1), die erste Abdominalganglien, A1 und A2, mit zugeordneten Nerven N1, N2 und N3 sind sichtbar (Figur 8). </li><li> Verwenden einer Pinzette in der linken Hand, um die Spezifikation zu packenimen an einer Öffnung der Laufbeine. In der folgenden Sektion Schritte ziehen Sie vorsichtig, um die Probe offen zu halten. </li><li> Durchschneiden die Nerven N3 an der entferntesten Position von der Nervenstrang. (Bild 8-3). </li><li> Schneiden Sie die Beugemuskeln in der Nähe des ventralen apodeme wie in Abbildung 8-4 gezeigt. Achten Sie darauf, den Nervenstrang oder die Nerven N2 beschädigen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.18 und 2.19 für die Nerven N3 und die Beugemuskeln des verbleibenden Bauchganglien A2 bis A5. </li><li> Bei der letzten Abdominalganglion, A6, schneiden Sie die Rückenbeugemuskeln von der ventralen apodeme und sollte die Probe, wie in Abbildung 9 gezeigt aussehen. </li><li> Schneiden Sie die Sternalplatte posterior an den Nerven der A6 (Bild 9-1) und halten Sie die Bauchteil (Bild 9-2). Entsorgen Sie das Rückenteil mit Beugemuskeln (Bild 9-3). Befestigen Sie die Sternalplatte vorne mit Nadeln durch die Öffnungen der Laufbeinen,und nach hinten bis A6. </li></ol> 3. Fein Dissection <ol><li> Legen Sie die Probe unter dem Mikroskop mit dem vorderen Teil weg gerichtet und den hinteren Teil in Richtung der Tabellen Rand. </li><li> Pinzette benutzen, wie in Figur 10A gezeigt ist, um die vorderen Teile der kephalothorakalen sterna entfernen. HINWEIS: Die Brustganglien und Nerven verbunden sind teilweise durch die Beinmuskulatur und kephalothorakalen sterna bedeckt. Kephalothorakalen sterna bilden ein Gerüst, das die seitlich angeordneten Hohlräume der Laufbeine voneinander und von der medialen Hohlraum, in dem die Bauchmark befindet trennt. </li><li> Schneiden die Muskeln zwischen den verbleibenden exoskeletal Strukturen, wie in 10B angegeben -1 und B2. Verwenden einer Pinzette zu greifen und heben Sie das vordere Ende des Bauchmark (Abbildung 10C). HINWEIS: Der Nervenstrang wird dabei beschädigt werden, vermeiden Abheben des nerve Kabel mehrmals. </li><li> Schneiden Sie die Thorakalnerven seitlich beim Anheben der Nervenstrang (10C-3). Bewahren Sie diese Nerven bei geeigneter Länge für das Feststecken. Entfernen Sie den gepressten Teil der Kette der Ganglien, die sich mit einer Pinzette aufgenommen wurde, durch Wegschneiden alle Gewebe anterior T4 (10C-4). </li><li> Legen Sie die Probe mit dem vorderen Teil auf der linken Seite und konzentrieren sich auf A1. Schneiden die Nerven N1 und N2 von A1 an einer geeigneten Länge (max. 1 cm) dem Pinnen sie aus. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf A2 und identifizieren die Nerven N1, N2 und N3 in diesem Segment (Abbildung 11). Die Nerven N1 Abdominalganglien A2-A5 liegen zwischen zwei Sternalpe kutikulären Einfaltungen in jedes Segment (11A-1) und von Muskeln bedeckt. Machen Sie einen Schnitt entlang der hinteren Brustbein Kutikula Einfaltung. Beginnen am seitlichen Rand der Bauch und dann in Richtung der Mittellinie, wie in 11A gezeigt. </li><li> Wenn die Ziel N1 noch Buchtrot mit Gewebe, wie in Figur 11B (roter Pfeil) gezeigt, entlang der Muskelbündel geschnitten, aber diesmal vorderen sowohl sternal kutikulären Einstülpungen und die Nerven N1 (11B-2). </li><li> Schneiden Nerven N1 als distal wie möglich (11C-3). Nerve N1 vollständig sichtbar ist und die vorderen und hinteren Niederlassung identifiziert werden können (Abbildung 11C). </li><li> Fahren Sie mit der kontralateralen Nerven N1 und ersten Schnitt die Muskeln entlang der hinteren Brustbein Kutikula Einfaltung, beginnend medial, in der Nähe des Ganglion (11D). Wenn der Nerv noch von Gewebe bedeckt ist, auf der Muskelbündel geschnitten, aber diesmal vorderen sowohl sternal kutikulären Einstülpungen und die Nerven N1, ähnlich zu 11B-2 Abbildung. Schneiden Sie den Nerven N1 als distal wie möglich. </li><li> Schneiden Sie die Nerven N2 dieses Ganglion auf eine geeignete Länge (ca. 0,5 cm) für das Feststecken. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,7 bis 3,11 für die Nerven der A3-A5. </li><li> Schneiden Sie den Download vonves von Ganglien A6 als distal wie möglich (Abbildung 12A). Verwenden einer Pinzette, um mehrere Nerven des A6 zu greifen, diese Ganglien heben und starten Isolierung der Kette von Ganglien von der Brustbeinplatte. </li><li> Heben Sie den Nervenstrang, ziehen Sie es vorsichtig in die vordere Richtung wie in 12B (weißer Pfeil) demonstriert. Da die einzelnen Ganglien aufgehoben werden, entfernen Sie die Bauchschlagader, die auf der Bauchseite der Nervenstrang (12C) befestigt werden kann. Setzen Sie diese (leicht) Pull-Schnitt-Sequenz, bis der Nervenstrang ist komplett isoliert. </li><li> Übertragen Sie die isoliert Kette von Ganglien in eine Petrischale mit klaren Sylgard gesäumten und mit Flusskrebsen Salzlösung (12D) gefüllt. </li></ol> 4. abstecken Nervenstrang in die Petrischale HINWEIS: Verwenden Sie kleine Stifte aus Edelstahldraht geschnitten (siehe Ergänzungsmittel), um den Nervenstrang zu befestigen. Berühren Sie nur die Nervenende mit der Zange und nicht squeezE die Verknüpfungen oder Ganglien. <ol><li> Pin der Kette von Ganglien in einer geraden Linie, während leichtem Stretch. </li><li> Ordnen Sie den Nervenstrang in der Petrischale mit der Rückenseite nach oben (Abbildung 13, schwarze Linie). Die ventrale Seite des Ganglien kann durch seine Konvexität identifiziert werden; die Rückenseite ist flach. Stecken Sie die Brustnerven an den Seiten. Weiterhin mit den Nerven A6, Strecken des Nervenstrang entlang seiner Längsachse. </li><li> Pinanordnung die Nerven der A1 in einem 90 ° Winkel relativ zu dem Nervenstrang. </li><li> Fahren Sie mit A2 und Pin die Nerven N2 in einem Winkel von 35 bis 45 ° gegenüber der Nervenstrang (1A). </li><li> Trennen Sie die Nerven N1 in ihrem vorderen und hinteren Äste vor Pinning wie in Abbildung 14 gezeigt. Mit zwei Paar feinen Pinzette zu holen mit einer Pinzette die vordere und mit der anderen den hinteren Ast des Nervus N1. Achten Sie darauf, nur den distalen Ende abholens der Nervenäste. Nun ziehen Sie sie sorgfältig auseinander. </li><li> Pin der vordere Ast des Nervus N1 in einem 90 ° Winkel relativ zu dem Nervenstrang (1A). Pin den hinteren Ast des Nervus N1 zwischen der vorderen N1 Zweig und dem Nerven N2. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,4-4,6 für die Nerven der Ganglien A3-A5. Während Fixierung der Nervenstrang Strecke in Längs- als auch in Querrichtung. </li></ol> 5. Desheathing die Ganglien <ol><li> Stellen Sie das Präparat in der Weise, dass die Hände des Experimentators werden immer auf eine stabile Ebene ruhen, um zu vermeiden Schütteln. Um desheath beleuchten die Ganglien des Nervenstrang von unten. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf jeden Abdominalganglion A1 bis A5. Verwenden Sie feinen Federschere, einen kleinen seitlichen Schnitt durch das Ganglion Mantel machen, posterior zum Ganglion und zwischen die Nerven N2 und N3 (15A roter Pfeil). </li><li> Nehmen Sie den Ganglien Mantel mit sehr fine Pinzette und quer über die Hülle über die Verknüpfungen zu schneiden, wie in 15A-1 angegeben. Achten Sie darauf, nicht zu drücken oder schneiden Sie den Nervenstrang mit der Schere. </li><li> Noch halten und Anheben des Ganglion Mantel mit einer Pinzette es weiterhin entlang der seitlichen Ränder des Ganglion (15B-2 und -3) geschnitten. Entfernen Sie den Mantel. Alternativ Pin es zu beiden Seiten der Verknüpfungen in einer Weise, dass sie befestigt ist aber der Nervenstrang nicht gequetscht. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,2-5,4 für alle Bauchganglien A1 bis A5. </li><li> Desheathe den Brustganglien und die Ganglien A6 in ähnlicher Weise. Um A6 Start vorderen zum Ganglion desheathe und fahren nach posterior. Pin das Ganglion Hülle des A6 bis zum hinteren Ende der Kette von Ganglien. </li></ol> 6. extrazellulären Recordings von Motoneuronen <ol><li> Montieren Sie alle Werkzeuge und Materialien für angezeigt i extrazelluläre Ableitungen verwendetn 16B und in den Ergänzungen aufgeführt. Ein Überblick über die Aufnahme-Setup ist in 16A gezeigt. Starten Sie alle Geräte in diesem Experiment (Abbildung 16C) verwendet, so dass die Verstärker können sich für mindestens 30 Minuten vor der Aufnahme zu wärmen. Schalten Sie den Computer und starten Sie die Aufnahme-Software. </li><li> Die Kette der Ganglien auf dem Mikroskoptisch und beleuchten von unten. Legen Sie die Aufnahme-Elektrode in die Sylgard in der Nähe des Zielnerven und der Referenzelektrode in einer Position in der Nähe, aber lateral der Ganglien (17A und B). Biegen Sie die Zielnerven um die Aufzeichnungselektrode (17C). </li><li> Dehnen Sie den Nerven leicht, um den Kontakt zwischen der Elektrode und dem Nerven gewährleisten und stecken Sie es auf der Seite (B ild 17D). Befestigen Sie die Elektrodenkabel mit dem Mikroskoptisch mit Modelliermasse, so dass sie in der gewünschten Position zu bleiben. </li><li> Verwenden Sie einSpritze mit Vaseline und einer 20-Gauge-Nadel (mit abgerundeten Spitze) gefüllt (17E-3), um das Zielnerven aus der Badlösung zu isolieren. Erste dab etwas Vaseline auf die Sylgard um die Aufzeichnungselektrode. Das Ergebnis ist eine Schicht Vaseline Abdecken der Sylgard in der Nähe der Aufzeichnungselektroden (17E-4). Achten Sie darauf, direkt auf die Nerven in dieser Schicht tupfen und vermeiden Sie Luftblasen. </li><li> Verschließen Sie die Aufzeichnungselektrode mit Vaseline von allen Seiten bis an die Oberfläche Ebene der Kochsalzlösung (17F). </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Zielnerven, deren Aktivität überwacht werden soll. </li><li> Starten Sie die Aufnahme. Verwenden Sie eine kontinuierliche oder eine Lücke frei Erfassungsmodus und eine Abtastrate von 5 kHz. Set für die extrazelluläre Verstärkers mit den folgenden Parametern; gewinnen, um 1000 (verstärkt das Signal 1000 mal darauf achten, dass diese Verstärkungsparameter in den Erfassungssoftware Einstellungen umfassen) einda Bandpassfilter Bereich von 300 Hz (Low Cut) auf 2000 Hz (high cut). </li></ol>

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	<li>Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Co-Ordination+of+Swimmeret+Movements+in+the+Crayfish,+Procambarus-Clarkii+(Girard).">The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard).</a> J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).</li><li>Mulloney, B., Smarandache, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifty+Years+of+CPGs:+Two+Neuroethological+Papers+that+Shaped+the+Course+of+Neuroscience.">Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience.</a> Front Behav Neurosci. 4, 45 (2010).</li><li>Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Separate+Local+Pattern-Generating+Circuit+Controls+the+Movements+of+Each+Swimmeret+in+Crayfish.">A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish.</a> J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).</li><li>Mulloney, B., Hall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+crayfish+abdominal+ganglia.+III.+Swimmeret+motor+neurons.">Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons.</a> J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).</li><li>Davis, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lobster+Righting+Responses+and+Their+Neural+Control.">Lobster Righting Responses and Their Neural Control.</a> Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).</li><li>Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+the+crustacean+swimmeret+system.">Neurobiology of the crustacean swimmeret system.</a> Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).</li><li>Huxley, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The crayfish: An introduction to the study of zoology. , (1980).</li><li>Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+types+of+nonspiking+interneurons+in+local+pattern-generating+circuits+of+the+crayfish+swimmeret+system.">Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system.</a> J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).</li><li>Skinner, F. K., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersegmental+coordination+of+limb+movements+during+locomotion:+mathematical+models+predict+circuits+that+drive+swimmeret+beating.">Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating.</a> J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).</li><li>Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=During+fictive+locomotion,+graded+synaptic+currents+drive+bursts+of+impulses+in+swimmeret+motor+neurons.">During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons.</a> J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).</li><li>Smarandache-Wellmann, C., Gr&#228;tsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+coordination+in+distributed+neural+circuits:+Encoding+coordinating+information.">Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information.</a> J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).</li><li>Mulloney, B., Hall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+commissural+interneurons+integrate+information+from+intersegmental+coordinating+interneurons.">Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons.</a> J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).</li><li>Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursts+of+information:+Coordinating+interneurons+encode+multiple+parameters+of+a+periodic+motor+pattern.">Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern.</a> J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).</li><li>Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+Rhythmic+Motor+Activity+by+Gradients+of+Synaptic+Strength+in+a+Neural+Circuit+That+Couples+Modular+Neural+Oscillators.">Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators.</a> J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).</li><li>Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Coordination+in+Distributed+Neural+Circuits:+Decoding+and+Integration+of+Coordinating+Information.">Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information.</a> J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).</li><li>Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-Dependent+Responses+of+2+Motor+Systems+in+the+Crayfish,+Pacifastacus+leniusculus.">State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus.</a> J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).</li><li>Chrachri, A., Neil, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+and+Synchronization+between+2+Abdominal+Motor+Systems+in+Crayfish.">Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish.</a> J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).</li><li>Skinner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structure+of+the+4th+Abdominal-Ganglion+of+the+Crayfish,+Procambarus-Clarki+(Girard)+II.+Synaptic+Neuropils.">The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils.</a> J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).</li><li>Skinner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structure+of+the+4th+Abdominal-Ganglion+of+the+Crayfish,+Procambarus-Clarki+(Girard)+I.+Tracts+in+the+Ganglionic+Core.">The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core.</a> J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).</li><li>Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectonics+of+crayfish+ganglia.">Architectonics of crayfish ganglia.</a> Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).</li><li>Braun, G., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+modulation+of+the+swimmeret+motor+system+in+crayfish.">Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish.</a> J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).</li><li>Davis, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motoneuron+Morphology+and+Synaptic+Contacts+-+Determination+by+Intracellular+Dye+Injection.">Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts - Determination by Intracellular Dye Injection.</a> Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).</li><li>Altman, J. S., Tyrer, N. M., Strausfeld, N. J., Miller, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+Selected+Neurons+with+Cobalt+through+Cut+Axons.">Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons.</a> Neuroanatomical Techniques. , 373-402 (1980).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

<html> Die Anatomie der Krebse und ihre Bauchganglien zuvor 5, 18, ​​19, 20 beschrieben, und es wird empfohlen, vor der Dissektion, um Schneiden von wichtigen Nerven zu vermeiden mit ihnen vertraut machen. Es ist entscheidend, um die Vorbereitung bei Temperaturen unter 23 ° C zu halten, um den Abbau des isolierten Nervenstrang zu vermeiden. Dies kann einfach durch Austausch der Badlösung alle 20-30 min mit kaltem Krebse Salz erreicht werden. Unter diesen Umständen ist die Ke...

Die swimmerets von Krebsen dienen eine Funktion in Lageregelung und schlugen rhythmisch, wenn die Tiere schwimmen freuen, lüften ihre Höhlen oder Weibchen ihre Eier belüften 5, 6. Die swimmerets der Signalkrebs, Pacifastacus leniusculus treten paarweise vom zweiten bis zum fünften Abdominalsegment, mit einem Schenkel auf jeder Seite des Bauches 7. Das Zentralnervensystem produziert eigener rhythmischen Motor Rüttler, der die swimmeret Bewegung in intakten Tier als auch in der isolierten Nervenstrang Herstellung antreibt. Wenn es keine sensorische Rückmeldung oder absteige gegenwärtigen Eingangs die erzeugte rhythmische Motormuster heißt fiktive Lokomotion 1, 2. Im swimmeret System dieser Motor Muster nicht in jedem Parameter aus der Aktivität der swimmerets im intakten Tier gemessen abweichen. Die Bewegung jedes swimmeret wird durch eine Mikroschaltung, die in sich und mit einem c beschränkt angetriebenhenden hemiganglion. 1 - 3 In jedem Mikro es eine Mustererzeugungs Kernel, der fünf identifizierten nicht Spiking Inter umfasst. Sie können funktionell als charakterisiert werden entweder Inhibitor of Power Stroke (IPS) oder Inhibitor of Return Stroke (IRS) 8. Diese IPS und IRS Inter nicht endogene Oszillatoren, sondern ihre Wechselaktivität wird durch reziproke Hemmung 9 angetrieben. Da diese Inter direkt hemmen die swimmeret Motoneurone wird die Wechsel PS-RS Bewegung erzeugt 10. Locomotion jedoch erfordert nicht nur die Erzeugung der Aktivität, sondern auch die Koordination der verschiedenen unabhängigen Mikroschaltungen. Im swimmeret System wird von der koordinierenden Mikroschaltung, die gewährleistet, dass Gliedmaßen richtigen Zeiten aktiv sind, eine solche Koordinierung etabliert. Diese Mikroschaltung wird von drei identifizierten Neuronen in jedem Segment 11 bis 15 aufgebaut. Dieses Protokoll sieht the erstmals ein Schritt-für-Schritt-Dissektion Führung, um die Kette der Ganglien (T4 bis A6, 1) zu isolieren. Wir zeigen, wie man den Stift isoliert Bauchnervenstrang und desheathe jedes Ganglion. In diesem isoliert Nervensystem Vorbereitung sind die Neuronen für swimmeret Bewegung verantwortlich bereit für den Einsatz in elektrophysiologischen und morphologischen Experimente. Der zweite Teil dieses Protokolls zeigt die Hauptmerkmale des Motor swimmeret Muster. Dies beinhaltet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum extrazellulär Rekord die Aktivität swimmeret Motoneuronen. Axone RS Motorneuronen projizieren durch den vorderen Ast von Nerven N1, während Axone PS Motorneuronen projizieren durch den hinteren Ast desselben Nerven (Abbildung 1) 4. Daher kann ihre Tätigkeit den folgenden Buchhandlungen mit Differenzstiftelektroden aufgezeichnet werden. <img alt="Figur 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig1highres.jpg" width="200" /><br/&gt; 1: Getrenntes Nervensystems aus Brustganglion 4 (T4) zu Abdominalganglion 6 (A6) und ein schematisches Diagramm davon T4. Brustganglion 4; T5: thorakalen Ganglion 5; A1, A2 ... A6 Abdominalganglion 1, Abdominalganglion 2 ... Abdominalganglion 6; N1: Nerven N1; N2: Nerven N2; N3: Nerven N3; PS: Macht-Takt; RS: Rücktakt. Directional Abkürzungen: A = Front; P = posterior. Diese Dissektion Verfahren und die elektrophysiologische Technik gezeigt, sind geeignet für Studenten und Schüler können Praktika in der Physiologie zu ergänzen. Die isolierte Kettenganglien wurde in einer Reihe von Versuchen verwendet worden, um Funktion des Nervensystems, Koordination oder Modulation swimmeret Mikro 6 sowie neuronalen Steuerung der adaptiven Verhaltens der Lokomotion 16, 17 untersucht werden. Das Krebs swimmeret System stellt somit einen enormen von interessanten Unterricht oder tregnet Möglichkeiten, die alle beginnen mit der Präparation der Bauchmark von Flusskrebsen und extrazelluläre Aufnahme der fiktiven Motor Muster.

<table><tbody><tr><td>4-channel extracellular amplifier: MA 102&amp;nbsp;</td><td>Amplifier</td><td>Elektroniklabor, Zoologie, Universit&amp;auml;t zu K&amp;ouml;ln, Germany</td><td></td></tr><tr><td>air-table</td><td></td><td>Technical Manufacturing Corporation&lt;br/&gt; (TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA</td><td>63-534</td></tr><tr><td>Axon Digidata 1440A</td><td>Digitizer</td><td>Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA</td><td>DD1440A</td></tr><tr><td>big bucket&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex &amp;amp; Clampfit</td><td>pClamp 10, recording and analysis software</td><td>Molecular Devices Design, Union City, CA</td><td>pClamps 10 Standard</td></tr><tr><td>cold lamp source</td><td>with flexible light guide (fiber optic bundle)&amp;nbsp;</td><td>Euromex microscopes holland, Arnhem, BD</td><td>LE.5211 &amp;amp; LE.5235</td></tr><tr><td>computer and monitor</td><td>equipped with recording software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>container and pipette for liquid waste&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>crayfish saline&amp;nbsp;</td><td>contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable)</td><td>fluorescent dye, lysine fixable</td><td>Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany</td><td>D3328</td></tr><tr><td>dissection dish&amp;nbsp;</td><td>(l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>faraday cage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fixing pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forceps (biology, Dumont #5)</td><td>Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>11252-20</td></tr><tr><td>forceps (biology, Dumont #55)</td><td>Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>11255-20</td></tr><tr><td>forceps (electronic, Dumont #5)</td><td>Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>11251-20</td></tr><tr><td>intracellular electrode</td><td>Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>BF100-50-10</td></tr><tr><td>Leica S8 Apo StereoZoom</td><td>Dissection Microscope&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Zoom 1x - 8x</td><td>Leica, Germany</td><td>10446298</td></tr><tr><td>microscope table</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirror</td><td>to illuminate preparation from below</td><td></td><td></td></tr><tr><td>modeling clay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZ61</td><td>Dissection Microscope&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Zoom 0.67x - 4.5x</td><td>Olympus, Germany</td><td></td></tr><tr><td>petri dish&amp;nbsp;</td><td>94 x 16 mm; lined with clear silicone</td><td>Greiner bio-one, Germany</td><td>633180</td></tr><tr><td>ring scissors</td><td>ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>14054-13</td></tr><tr><td>spring scissors or alternative: Vannas spring scissors</td><td>cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>15024-10 or&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 15000-08</td></tr><tr><td>student Vannas&amp;nbsp; spring scissors or alternative:&amp;nbsp; Moria Spring Scissors</td><td>cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>91500-09 or&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 15396-00</td></tr><tr><td>sylgard</td><td>184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon</td><td>Dow Corning, Midland, MI, USA</td><td></td></tr><tr><td>syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the swimmeret system of crayfish: a practical guide for the dissection of the nerve cord and extracellular recordings of the motor pattern

Hier zeigen wir die Dissektion der Krebse Bauchnervenstrang. Die Herstellung umfasst den letzten zwei Thoracalganglien (T4, T5) und die Kette der Abdominalganglien (A1 bis A6). Diese Kette von Ganglien umfasst den Teil des zentralen Nervensystems (ZNS), die koordinierte Bewegungs der Pleopoden (swimmerets) treibt: der swimmeret System. Es ist für mehr als fünf Jahrzehnten, die in Flusskrebse jeweils swimmeret wird durch eine eigene, unabhängige Mustererzeugungs Kernel, der rhythmischen Wechselaktivität 1-3 erzeugt angetrieben bekannt. Die Motoneuronen innervieren die Muskulatur jeder swimmeret anatomisch und funktionell unterschiedliche Populationen 4 umfassen zwei. Einer ist für den Rückzug (Arbeitstakt, PS) des swimmeret verantwortlich. Die andere treibt die Verschleppung (Rücklauf, RS) des swimmeret. Motoneuronen des swimmeret Systems sind in der Lage, spontan eine fiktive Motor Muster, welches identisch mit dem in vivo aufgezeichnete Muster ist </em&gt; 1. Das Ziel dieses Berichts ist es, eine interessante und bequeme Modellsystem zur Untersuchung Rhythmus erzeugenden Netzwerke und Koordination von unabhängigen Mikroschaltungen aus praktischen Laborkurse Schüler einzuführen. Die zur Verfügung gestellten Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Präparation der Bauchnervenstrang der Krebse ist, Pinning der isoliert Kette von Ganglien, desheathing die Ganglien und die Aufzeichnung der swimmerets fiktiven Motor Muster extrazellulär aus dem isolierten Nervensystem. Darüber hinaus können wir die Aktivität von Neuronen swimmeret intrazellulär von Dendriten, aufgezeichnet. Hier beschreiben wir kurz auch diese Techniken und stellen einige Beispiele. Weiterhin kann die Morphologie swimmeret Neuronen mit Färbetechniken beurteilen. Hier stellen wir Beispiele für intrazelluläre (durch Iontophorese) Farbstoff gefüllt Neuronen und Hinterfüllungen von Pools von swimmeret Motoneuronen. In unserem Laborwir diese Vorbereitung auf die Grundfunktionen des fiktiven Fortbewegung, die Wirkung der sensorischen Rückmeldung über die Aktivität des ZNS, und die Koordinierung zwischen Mikroschaltungen auf zellulärer Ebene zu untersuchen.

Mit der gleichzeitigen extrazelluläre Ableitungen von RS und PS, Motorneuronen von einem Ganglion, das Wechselaktivität dieser Motorneuronenpools, kann überwacht werden (Abbildung 18), die die fiktive Fortbewegungsmuster. <img alt="18" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig18highres.jpg" /> Abbildung 18: Schematische Darstellung einer Ganglien und Platzierung der Differenzstiftelektrode extrazellulären Aufzeichnung von RS Motorneuronen (obere Kurve) ...

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The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Die swimmeret System der Crayfish: Ein praktischer Leitfaden für die Dissektion der Nervenstrang und extrazellulären Recordings der Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K Aufrufe.  University of Cologne. Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons. 

Serie: The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

Physiologische Aufnahmen von High-und Low Output NMJs auf der Crayfish Leg Streckmuskel

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Forschung

Neurowissenschaften

Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that influence a cell's membrane potential and which we address in these experiments are: (1) Ion concentration of K+ on the outside of the membrane, and (2) the permeability of the membrane to specific ions. The crayfish abdominal extensor muscles are in groupings with some being tonic (slow) and others phasic (fast) in their biochemical and physiological phenotypes, as well as in their structure; the motor neurons that innervate these muscles are correspondingly different in functional characteristics. We use these muscles as well as the superficial, tonic abdominal flexor muscle to demonstrate properties in synaptic transmission. In addition, we introduce a sensory-CNS-motor neuron-muscle circuit to demonstrate the effect of cuticular sensory stimulation as well as the influence of neuromodulators on certain aspects of the circuit. With the techniques obtained in this exercise, one can begin to answer many questions remaining in other experimental preparations as well as in physiological applications related to medicine and health. We have demonstrated the usefulness of model invertebrate preparations to address fundamental questions pertinent to all animals.

The experiments demonstrate an easy approach for students to gain experience in examining muscle structure, synaptic responses, the effects of ion gradients and permeability on membrane potentials. Also, a sensory-CNS-motor-muscle circuit is presented to show a means to test effects of compounds on a neuronal circuit.

Membranpotentiale, Synaptic Responses, neuronalen, Neuromodulation und Muscle Histologie Mit dem Crayfish: Schülerlabor Übungen

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that ...

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this experiment is to learn anatomy of the preparation by staining, dissection and viewing of neurons and sensory structures under a dissecting microscope. This is performed by using basic neurophysiological equipment to record the electrical activity from a joint receptor organ and staining techniques. The muscle receptor organ (MRO) system in the crayfish is analogous to the intrafusal muscle spindle in mammals, which aids in serving as a comparative model that is more readily accessible for electrophysiological recordings. In addition, these are identifiable sensory neurons among preparations. The preparation is viable in a minimal saline for hours which is amenable for student laboratory exercises. The MRO is also susceptible to neuromodulation which encourages intriguing questions in the sites of modulatory action and integration of dynamic signals of movements and static position along with a gain that can be changed in the system.

The primary purpose of this experiment is to understand how primary sensory neurons convey information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this report is present the anatomy of the preparation by dissection and viewing of neurons under a dissecting microscope.

Muscle-Rezeptor-Organe in der Crayfish Abdomen: Ein Schülerlabor Übung in Propriozeption

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive ...

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Biologie

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Dissecting und Aufnahme von C. elegans neuromuskulären Synapse

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. Traditional non-invasive methods require at least partially restrained research subjects, and they only allow identification of large numbers of simultaneously activated neurons. On the other hand, small ensembles of neurons or individual neurons can only be measured using single-cell recordings obtained from largely reduced preparations. Since the expression of natural behavior is limited in restrained and dissected animals, the underlying neural mechanisms that control such behavior are difficult to identify. 
Here, I present a non-invasive physiological technique that allows measuring neural circuit activation in freely behaving animals. Using a pair of wire electrodes inside a water-filled chamber, the bath electrodes record neural and muscular field potentials generated by juvenile crayfish during natural or experimentally evoked escape responses. The primary escape responses of crayfish are mediated by three different types of tail-flips which move the animals away from the point of stimulation. Each type of tail-flip is controlled by its own neural circuit; the two fastest and most powerful escape responses require activation of different sets of large &#8220;command&#8221; neurons. In combination with behavioral observations, the bath electrode recordings allow unambiguous identification of these neurons and the associated neural circuits. Thus activity of neural circuitry underlying naturally occurring behavior can be measured in unrestrained animals and in different behavioral contexts.

Non-invasive measurements of neural activity patterns in freely behaving animals are obtained by combining neurophysiological recordings with high speed videography.

Recordings of Neural Circuits Aktivierung in Frei Behaving Tiere

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extrazellulär identifizieren Motor Neurons für einen Muscle Motor Pool in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological effects of insecticides. This article describes the scope of cockroach sensory modalities that can be used to assay how an insect nervous system responds to environmental perturbations. Emphasis here is on the escape behavior mediated by cerci to giant fiber transmission in Periplaneta americana. This in situ preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of neuronal activity. Peptides or other chemical reagents can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline. Insecticides could also be administered prior to dissection and the escape circuit can serve as a proxy for the excitable state of the central nervous system. In this context the assays described herein would also be useful to researchers interested in limb regeneration and the evolution of nervous system development for which P. americana is an established model organism.

This article describes the cockroach ventral nerve cord dissection and extracellular recordings from the cercal nerve and connectives. Evoked responses are generated by electrical stimulation of the cercal nerve or direct mechanical stimulation of the cerci.

Neuronalen Schaltkreis-Aufnahme von einem intakten Nervensystem Schabe

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is still much to learn from this model preparation. In understanding the history one can appreciate why even today this NMJ still offers a rich playground to address questions regarding pre- and post-synaptic function and plasticity. The viability and ease of access to the terminal for intracellular as well as extracellular electrophysiology and imaging are significant advantages. The mechanisms behind the modulation of vesicular kinetics and fusion within the high- and low-output terminals are begging for investigation. The preparation also offers a testable model system for computational assessments and manipulations to examine key variables in theoretical models of synaptic function, for example calcium dynamics during short-term facilitation. The synaptic complexity of active zone and statistical nature of quantal release is also an open area for future investigation both experimentally and computationally.

The opener muscle of the crayfish leg is presented for its historical importance and experimental versatility in muscle phenotype, synaptic physiology and plasticity.

Historische Ansicht und Physiologie Demonstration am NMJ der Crayfish Opener Muscle

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons responsible for proprioception as they are detecting joint position and movement, and muscle tension. Electrical activity from crustacean proprioceptors and tension receptors is recorded by basic neurophysiological instrumentation, and a transducer is used to simultaneously measure force that is generated by stimulating a motor nerve. In addition, we demonstrate how to stain the neurons for a quick assessment of their anatomical arrangement or for permanent fixation. Staining reveals anatomical organization that is representative of chordotonal organs in most crustaceans. Comparing the tension nerve responses to the proprioceptive responses is an effective teaching tool in determining how these sensory neurons are defined functionally and how the anatomy is correlated to the function. Three staining techniques are presented allowing researchers and instructors to choose a method that is ideal for their laboratory.

Physiological and anatomical techniques are demonstrated to address function and structure for joint proprioceptors and muscle tension receptors in crustacean walking limbs.

Propriozeption und Spannungsrezeptoren in Crab Gliedmassen: Schülerlabor Übungen

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...