Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 bis KD und RW) unterstützt. Wir danken Thomas Euler (Töbingen, Deutschland) für das Licht Stimulation Software QDS.

Die folgende Beschreibung geht davon aus, dass der Experimentator ein grundlegendes Verständnis der retinalen Struktur, Patch-Clamp-Aufzeichnung, und zwei-Photonen-Mikroskopie hat. Für nützliche Informationen über die Einrichtung und den Betrieb eines Patch-Clamp-Setup und Zwei-Photonen-Imaging-System siehe Lit. [7-12]. 1. Tier-und Gewebe-Vorbereitung <ol><li> Halten Sie mit der Maus für mindestens 3 h dunkel-adaptierten In der Zwischenzeit bereiten 1-2 l extrazellulärer Lösung, bestehend aus (in mm) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 CaCl 2, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-Glucose und äquilibrieren es auf pH 7,4 durch Begasung mit Carbogen (5% CO 2 in O 2) bei Raumtemperatur. </li> ein <li> Euthanize der Maus in eine luftdichte Kammer, die durch CO 2 Überdosierung durch Genickbruch folgte. Dieses Verfahren und die folgenden Schritte sollten in der Dunkelheit durchgeführt werden. Verwenden Sie dim langwelligen Beleuchtung (wir Block kurzen Wellenlängen aus einer Kaltlichtquelle durch eine 690 nm-longpass Filter) zur Unterstützung der persönlichen Vision und dabei die Augen des Tieres dunkel-adaptierten (Mäuse haben nur schlechte Sicht in den roten Teil des Lichtspektrums). Für die Arbeit in völliger Dunkelheit mit Infrarot-Beleuchtung (&gt; 800 nm) und tragen Nachtsichtgeräte. </li><li> Entkernen Augen mit einem Paar von gekrümmten Iris Schere und übertragen Sie sie auf einen Teller extrazellulären Lösung unter einem Binokular gelegt. </li><li> Entfernen Sie die Hornhaut und des Ziliarkörpers durch das Öffnen der Augen Glühbirne an der ora serrata (der Grenze zwischen Netzhaut und Ziliarkörper) mit einem Paar Frühling Schere (verwenden wir zunächst eine Lanzette zu durchbohren Ausgangspunkt für das Schneiden). Nehmen Sie die Linse und sorgfältig trennen die Netzhaut vom Pigmentepithel. Wenn die Ausrichtung der Netzhaut ist entscheidend für Ihre Studie zeigen, dass er wie in Ref. [12]. Schneiden Sie den Sehnerv zwischen Netzhaut und Pigmentepithel und entfernen Sie die Netzhaut von der Augenmuschel. Beachten Sie die Richtung des retinalen Oberflächen: das Innere des eingerollt-up Netzhaut ist die ganglIonen-Zellen-Seite, die außerhalb der Photorezeptor Seite. </li><li> Entfernen Sie den Glaskörper aus der inneren Netzhaut durch leichtes Ziehen Sie ihn mit Hilfe eines hölzernen Zahnstocher. Zu diesem Zweck verwenden Sie eine kleine Menge der extrazellulären Lösung, deckt gerade die Netzhaut. Der Glaskörper klebt an den Zahnstocher und zentrifugal aus der Netzhaut gezogen werden. Dann bewerben kurze Schnitte entlang der retinalen Umfang zu erleichtern Abflachung des Gewebes. </li><li> Übertragen Sie die Netzhaut in der Aufnahme Kammer Photorezeptor-Seite nach unten, breitete es auf dem Glasboden (wir verwenden eine feine Bürste) und fixieren es mit einem Nylon-aufgereiht Rahmen aus Edelstahl. Bereiten Sie die zweite Netzhaut in gleicher Weise und halten Sie es in carboxygenated extrazellulären Lösung für den späteren Gebrauch dunkel angepasst. </li></ol> 2. Recordings <ol><li> Installieren Sie die Aufnahme Kammer im Dunkeln unter einer aufrechten Laser Scanning Mikroskop und superfuse der Netzhaut Vorbereitung kontinuierlich (nicht weniger als 5 ml / min) mit carboxygenated extrazellulären Lösung auf 35 ° C erhitzt Das Mikroskop (auch mit einer Infrarot-empfindliche CCD-Kamera ausgestattet) befindet sich auf einem stoßdämpfenden Luft Tabelle in einem Faraday-Käfig für die elektronische Abschirmung entfernt. Bedecken Sie den Käfig mit einem nicht-transparenten Vorhang für die Vorbereitung in der Dunkelheit zu halten. Wir haben auch off Licht von Computermonitoren Bildschirm durch rote transparente Folie. </li><li> Tune die Infrarot-Laser 850-870 nm oder längeren Wellenlängen, wechseln Sie in modengekoppelten Zustand und die Verwendung der Zwei-Photonen Anregung von GFP-exprimierenden Zellen zu visualisieren. Dämpfen Sie den Laser-Ausgang mit Neutralfilter durch die Laser-Scanning-Software bis zu einem gewissen Grad, der gerade ausreicht für eine klare Anerkennung der fluoreszierenden Zellen gesteuert wird </li><li> Für Patch-Clamp-Aufnahmen in Current-Clamp-Modus verwenden Glasmikropipetten (wir verwenden Borosilicatglasröhren von 1,5 mm Außendurchmesser und 0,225 mm Wandstärke) mit intrazellulären Lösung, bestehend aus (in mm) 125 K-Gluconat, 10 KCl, 0,5 EGT gefülltA, 10 HEPES, titriert auf pH 7,4 mit KOH (was eine Pipette Widerstand von etwa 5 MW). Beachten Sie, dass andere experimentelle Bedingungen wie Voltage-Clamp-Aufzeichnung eine andere Lösung erfordern. Wenn Farbstoff Injektionen gewünscht werden, fügen Sie eine fluoreszierende Sonde (wir verwenden 10 mM Alexa Fluor 594) oder ein Tracer-Molekül (3% Neurobiotin). Legen Sie die Mikropipette in die Halterung und stellen Sie sicher, dass die Referenzelektrode (chlorierte Silberdraht) in Kontakt mit der extrazellulären Lösung in der Aufnahme Kammer ist. </li><li> Druck auf die Mikropipette und Ziel einer GFP-exprimierenden Zellen (wir verwenden eine 40-fach Wasserimmersionsobjektiv; NA 1,25). Amakrine Zellkörper in den Ganglienzellen (direkt unter der Oberfläche in der aktuellen Ausrichtung der Netzhaut) sowie in den proximalen Teil der inneren Körnerschicht (etwa 55-75 um tief in der Vorbereitung) gelegen. Vor Mikropipette Kontakt mit der Zielzelle, die innere Grenzmembran (eine Hülle aus Gliazellen endfeet gemacht) an der NetzhautOberfläche durchdrungen werden. Erfolgreiche Penetration durch intrazelluläre Lösung, die aus der Mikropipette Spitze getrieben wird und löst die innere Grenzmembran von der zugrunde liegenden Retina wie auf eine Infrarot-Übertragung Bild von der IR-CCD-Kamera aufgenommen beobachtet werden anerkannt. </li><li> Nähern Sie sich dem gewünschten Zelle durch den Vergleich der soma Position aus der Zwei-Photonen-Bild mit dem Bild der IR-CCD-Kamera, die die Position der Aufnahme Mikropipette. Beachten Sie, dass dieser Schritt nicht leicht zu erreichen und erfordert etwas Übung, weil die GFP-exprimierenden Zelle hat, um in der Infrarot-Übertragung Bild erkannt werden, um die Mikropipette auf sie zu lenken. Korrekte Ausrichtung ist erreicht, wenn die Mikropipette Spitze verursacht Dellen von der Zelloberfläche, die in der Zwei-Photonen-Bild zu sehen ist. Alternative zu diesem Verfahren mit einem Fluoreszenzfarbstoff (zB Alexa Fluor 594, 100 uM) in der intrazellulären Lösung der Mikropipette Position in der Zwei-Photonen-Bild zeigen. Zwei-Photonen-Anregung Infrarot ermöglicht eine ausreichende Fluoreszenz dieses Farbstoffs, um die Mikropipette erkennbar. Zu diesem Zweck stellen Sie den Erfassungsbereich in der Laser-Scan-Software, um auch rote Fluoreszenz. </li><li> Lassen Sie den Druck aus der Mikropipette und erhalten eine whole-cell Patch-Clamp-Konfiguration in Current-Clamp-Modus. Eine brauchbare Aufnahme sollte ein Membranpotential von -50 bis -55 mV und dauern mindestens 20 min. </li><li> Gegenwärtige optische Reize durch eine Stimulation Software (wir verwenden QDS von Thomas Euler, Universität Tübingen, Deutschland) 11 auf einem Computer-Monitor erstellt. Passen Sie die räumliche Lage der Stimulation auf das aufgenommene Zelle zentriert werden: Markieren Sie die Zelle Position auf dem Monitor zeigt die Übertragung Bild der IR-CCD-Kamera und in der Mitte punktförmig Reiz auf ihn. Tune der Reizintensität durch Einfügen Neutralfilter in den Strahlengang. Für die Kalibrierung des Monitors Spektrum und Intensität siehe Ref. [14]. Wählen Sie eine prolonged Interstimulus Intervall (zB 15 s) zu vermeiden Anpassung. Fügen Sie eine Photodiode in den Strahlengang zur Aufzeichnung des Stimulus Timing zu halten. </li><li> Starten Sie den Stimulationsprotokoll und notieren Sie die leichte Reaktionen (wir verwenden eine Abtastrate von 10 kHz mit Filterung bei 5 kHz für Nicht-Spike-Zellen, für Spike-Aufnahme eine höhere Abtastrate wie 20 kHz wird empfohlen). Verwenden Sie das Licht Stimulation Software, um die Aufnahme-Software auslösen. </li><li> Für Farbstoff füllen lassen fluoreszierendes Mittel diffundieren in die Zelle aufgenommen und 30-45 min vor sorgfältig Zurückziehen der Mikropipette aus der Zelle. Achten Sie darauf, sich aus dem Zellkörper. Wenn die nicht-fluoreszierenden Tracer Neurobiotin verwendet wurde, muss es Visualisierung durch Bindung an Streptavidin konjugiert mit einem Fluorophor (wir verwenden Streptavidin-Cy3, 1:400 über Nacht bei 4 ° C nach 20 min Paraformaldehyd Fixierung der Netzhaut; für Farbstoff-Kopplung Studien Streptavidin Inkubationszeit kann bis 3 d verlängert werden). Alternativ kann die Injektion auch mit durchgeführt werdenscharfen Elektroden (&gt; 100 M), wenn der Farbstoff iontophoretisch in den aufgespießt Zelle (Rechteckimpulse: 0,25-1 nA, 100 ms, 100 ms Intervall, Gesamtzeit 3-6 min) angetrieben. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Die folgenden Ergebnisse stammen aus einer Studie über eine Maus, die grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Promotor für Tyrosinhydroxylase 13,14, das Enzym katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in Katecholamin-Synthese (TH:: GFP-Maus). Basierend auf die Helligkeit des GFP-Signal zwei getrennte Zellpopulationen zu unterscheiden sind (Abbildung 2A). Zellen, die das höhere GFP-Ebene besitzen Zellkörper in der inneren Körnerschicht (INL, Abbildung 2a) oder Vertriebene in den Ganglienzellen (GCL, 2B) und schichten in der Mitte der inneren plexiformen Schicht (IPL, Abbildung 2C) . Sie wurden als Typ-2-Zellen 14-16 identifiziert und könnte systematisch in Bezug auf Morphologie untersucht werden (Abbildung 3) und wählenrische Aktivität (Abbildung 4), obwohl die Bevölkerungsdichte beträgt nur 250 Zellen / mm 2. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus. Zwei-Photonen-Anregung (rot gepunktete Lichtweg) von Fluorophor-exprimierenden Zellen im intakten Netzhaut ermöglicht die visuelle Ausrichtung nach einer Mikropipette (grüne Emission Lichtweg). Die Netzhaut ist auf optische Reize durch den Kondensator des Mikroskops (gelb Lichtweg) projiziert unterzogen und zellulären Licht Antworten werden aufgezeichnet. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" /> Abbildung 2. GFP-exprimierenden Zellen in einer retinalen Flatmount eines TH:: GFP-Maus. Typ-1-Zellen (DA-Zellen) in der INL mit schwacher Fluoreszenz (A, siehe Pfeile) befinden und intensiv beschriftet Typ-2-Zellen: Zwei Populationen können durch die Helligkeit des GFP-Signals unterschieden werdenmit Zellkörper entweder in der INL (A, siehe Pfeile) oder Vertriebene in der GCL (B) und einer dendritischen Schichtung in Stratum S3 der IPL (C). Scale-Bars, 50 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" /> Abbildung 3. Morphologie eines Typ-2-Zellen mit dem Tracer Neurobiotin injiziert. Der Tracer wurde anschließend visualisiert durch Streptavidin-Cy3 Bindung (magenta). Die Aufnahme, die auch der Darstellung ist die GFP-Signal (grün), ist eine Projektion der Bildstapel für die GCL und IPL. Scale-bar, 50 um. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" /> Abbildung 4. Leichte Reaktionen eines Typ-2-Zellen in der GCL entfernt. Antwort-Muster, um weißes Licht voll-Beleuchtung mit zunehmender Intensität in den skotopischen Bereich. Reizintensität ist in Photoisomerisierungen pro Stange pro Sekunde (Rh * / rod / s) angegeben. Eine anhaltende Stimulus von 3 s wurde zur besseren deutliche verwendetion der Antwort Komponenten bei Beginn des Stimulus (ON response) und Offset (OFF-Antwort).

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+light-evoked+calcium+signals+in+the+functionally+intact+retina.">Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).</li></ol>

Die Mäuse wurden behandelt und eingeschläfert in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts für Tierschutz und die Gesetze zu Tierversuchen von der deutschen Regierung begeben werden.

Diese Methode bietet die Möglichkeit, elektrischen Eigenschaften von bestimmten Nervenzellen im intakten Netzhaut unter Sichtkontrolle ohne Einfluss auf die Anpassungsvarianten Zustand der Netzhaut zu untersuchen. Es ist besonders für die Charakterisierung von Zellen, die derzeit eher schlecht studiert aufgrund der geringen Bevölkerungsdichte wie die meisten Populationen von Amakrinzellen geeignet. Zwei-Photonen-Anregung ermöglicht hochauflösende und kontrastreiche Abbildungen auch aus tieferen Teilen des Gewebes 17, eine Voraussetzung für die präzise Ausrichtung und erfolgreiche Patch-Clamp-Zellen vor allem in den INL mit seiner hohen Dichte der Zellkörper. Die isolierten Maus Netzhaut lebensfähig ist für 3-4 h unter den experimentellen Bedingungen. Wenn die zweite Netzhaut in völliger Dunkelheit unter ständiger Carbogen Begasung gespeichert wird, behält es die violette Farbe des ungebleichten Photopigment und kann nach Abschluss Experimente mit der ersten Netzhaut verwendet werden. In der Anfang, die auf dasausgewählten Zelle mit der Mikropipette in die Netzhaut wholemount ist ein bisschen schwierig und erfordert einige Übung, vor allem bei Arbeiten in der Dunkelheit. Inklusive einem Fluoreszenzfarbstoff in der Mikropipette kann Vereinfachung des Verfahrens, weil die Zelle und Mikropipette sichtbar unter zwei-Photonen-Anregung sind zur gleichen Zeit. Allerdings kann das Hinzufügen von Komponenten, um die intrazelluläre Lösung behindern Gigaseal Bildung oder führen Sie die Aufnahmequalität zu leiden. Nach erfolgreich erreicht, kann eine gute Aufnahme für ca. 1 h. letzten Während die Infrarot-Anregung Licht selbst nur schlecht von der Netzhaut absorbiert, aufgeregt GFP-exprimierenden Zellen emittieren im sichtbaren Teil des Spektrums Licht. Allerdings sind Fluorophore nur in einem kleinen Fokalvolumen, die nicht geeignet ist, die Anpassungsvarianten Zustand der Netzhaut verändern aufgeregt. Umso mehr, Erregung ist nur für die Ausrichtung benötigt und kann während der Aufnahme von Licht Reaktionen ausgeschaltet werden. Die usefulness für diesen Ansatz ist bereits durch Studien über spezifische Populationen von Amakrinzellen 14,18, aus dem elektrophysiologischen Ableitungen sonst nur durch Zufall 12 haben gezeigt hätten. Schließlich kann diese leistungsfähige Technik weiter, indem sie eine pharmakologische Ansatz 14, Ca 2 +-Imaging 19 oder indem Sie injizierten Zellen für immunzytochemische Studien oder Elektronenmikroskopie ausgebaut werden. Auf diese Weise kann die funktionelle Position eines bestimmten Zelltyp in der retinalen Schaltkreise entschlüsselt werden.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagent / Equip-ment </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Nachtsichtgeräten </td><td> Gutzeit GmbH, Warthausen, Deutschland </td><td> Xtron F1 </td><td> umfasst ein 800 nm-Lichtquelle </td></tr><tr><td> Optische Filter </td><td> Schott, Mainz, Deutschland </td><td> RG9 </td><td> Langpassfilter mit cutoff bei 690 nm </td></tr><tr><td> Iris Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 14061-09 </td><td> gebogen mit 22 mm Klinge </td></tr><tr><td> Frühling Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 15000-00 </td><td> Gerade mit 3 mm Klinge </td></tr><tr><td> Recording Kammer </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Deutschland </td><td> 200 bis 100 500 0180 Typ A (TC) </td><td> Teflon Kammer mit untenliegender Deckglas (ca. 0,15 mm, Nr. 2-100 500 0182) </td></tr><tr><td> Durchlauferhitzer </td><td> Multichannel Systems, Reutlingen, Deutschland </td><td> PH01, TC01 </td><td> beheizbaren Perfusionskanüle mit Temperatur-sEnsor und Temperaturregler </td></tr><tr><td> Laser-Scanning-Mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> DM LFS </td><td> gesteuert durch Leica Confocal Software </td></tr><tr><td> Air Tisch </td><td> Newport </td><td> VH 3036W-OPT </td><td></td></tr><tr><td> Laser </td><td> Spectra-Physics </td><td></td><td> Tsunami modengekoppelten Ti: Saphir-Laser </td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> PCO AG, Kelheim, Deutschland </td><td> Pixelfly QE </td><td> einschließlich Steuerungs-Software </td></tr><tr><td> Micropipette Glaskapillaren </td><td> Hilgenberg, Malsfeld, Deutschland </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette puller </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-20004 </td><td> Fluoreszenzfarbstoff </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC-SP-1120-M050 </td><td> nicht-fluoreszierenden Tracers </td></tr><tr><td> Streptavidin-Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Deutschland </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> motorisierten Mini25 Manipulators mit Anzeige SM-5 </td></tr><tr><td> Patch-Clamp-Verstärkers </td><td> npi electronic GmbH, Tamm, Deutschland </td><td> SEC-05LX npi </td><td></td></tr><tr><td> Digitizer </td><td> National Instruments </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> Datenerfassungssoftware WinWCP </td><td> John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> Visuelle Reizgenerators QDS </td><td> Thomas Euler, Universität Tübingen, Deutschland </td><td></td><td> muss auf einem separaten Computer Steuerung von 2 Monitoren (User Interface, Stimulus-Monitor) betrieben werden </td></tr><tr><td> Neutralfilter </td><td> ITOS, Mainz, Deutschland </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina

Die Untersuchung der physiologischen Eigenschaften und synaptischen Verbindungen von bestimmten Nervenzellen im intakten Gewebe ist eine Herausforderung für die Zellen, die auffällige morphologische Merkmale fehlen oder zeigen eine geringe Bevölkerungsdichte. Dies gilt insbesondere für Netzhaut-Amakrinzellen, ein außerordentlich vielgestaltige Gruppe von Interneuronen, dass rund 30 Subtypen bei Säugetieren 1 umfassen. Obwohl er ein wesentlicher Bestandteil der visuellen Verarbeitung durch die Formgebung der Netzhaut Ausgang 2, haben die meisten dieser Subtypen nicht bis jetzt in einen funktionalen Zusammenhang untersucht, weil das mit diesen Zellen mit einer Aufnahme-Elektrode ist ein seltenes Ereignis. In jüngster Zeit ist eine Vielzahl von transgenen Mauslinien zur Verfügung, die zum Ausdruck Fluoreszenzmarker wie grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle von Promotoren für die Membran-Rezeptoren oder Enzymen, die spezifisch für nur eine Teilmenge von Neuronen in einem bestimmten Gewebe 3,4 sind. Diese Pre-markierten Zellen werden daher accessible zu richten Mikroelektroden-Targeting unter mikroskopischer Kontrolle, ermöglicht die systematische Untersuchung ihrer physiologischen Eigenschaften in situ. Allerdings ist Anregung von fluoreszierenden Markern durch das Risiko der Phototoxizität für die lebenden Gewebe begleitet. In der Netzhaut, ist dieser Ansatz zusätzlich durch das Problem erschwert, dass Anregungslicht entsprechende Stimulation der Photorezeptoren und damit bewirkt, zuzufügen Photopigment Bleichen und die Übertragung der Netzhaut Schaltungen in ein Licht-adaptierten Zustand. Diese Nachteile werden durch Verwendung von Infrarot-Anregung durch einen modengekoppelten Laser in kurzen Pulsen von Femtosekunden-Bereich geliefert zu überwinden. Zwei-Photonen-Anregung bietet genügend Energie für Fluorophors Erregung und gleichzeitig schränkt die Anregung zu einem kleinen Gewebevolumen Minimierung der Gefahren von Lichtschäden 5. Auch lässt er die Netzhaut reagiert auf visuelle Reize, da Infrarot-Licht (&gt; 850 nm) nur schlecht durch Photopigmente 6 absorbiert. in situ Aufnahmen elektrophysiologischen von GFP-exprimierenden Zellen, die optisch durch Zwei-Photonen-Anregung ausgerichtet sind. Die Netzhaut ist vorbereitet und gepflegt in der Dunkelheit und kann auf optische Reize, die durch den Kondensator des Mikroskops (Abbildung 1) projiziert werden, unterworfen werden. Patch-Clamp Aufnahme von Licht Reaktionen können mit Dye-Füllung, um die Morphologie zu offenbaren und für Gap Junction-vermittelte Farbstoff Kopplung an benachbarte Zellen zu überprüfen, so dass die Zielzelle kann auf verschiedenen experimentellen Ebenen untersucht kombiniert werden.

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Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Dieser Artikel zeigt die Aufzeichnung der einzelnen Zellen aus fluoreszenzmarkierten neuronaler Populationen im intakten Maus Netzhaut. Durch die Verwendung von Zwei-Photonen-Anregung Infrarot transgenetically markierten Zellen wurden für Patch-Clamp-Aufzeichnung gezielt ihr Licht Antworten rezeptiven Feld Eigenschaften und Morphologie zu studieren.

Elektrophysiologische Charakterisierung von GFP-exprimierenden Zellpopulationen in der intakte Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

electrophysiological-characterization-gfp-expressing-cell-populations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K Aufrufe.  University of Oldenburg. Dieser Artikel zeigt die Aufzeichnung der einzelnen Zellen aus fluoreszenzmarkierten neuronaler Populationen im intakten Maus Netzhaut. Durch die Verwendung von Zwei-Photonen-Anregung Infrarot transgenetically markierten Zellen wurden für Patch-Clamp-Aufzeichnung gezielt ihr Licht Antworten rezeptiven Feld Eigenschaften und Morphologie zu studieren.

Serie: Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

Organotypischen Kultur der GFP-exprimierenden Maus Embryonen für Real-time Imaging der peripheren Nerven Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Intact Histologische Charakterisierung von Brain-implantierten Microdevices und des umgebenden Gewebes

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Beurteilung der Gefäß Regeneration im ZNS Verwenden der Maus Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. This method was first utilized in the study of Nestin-expressing progenitors (NEPs), a newly identified population of cells in the cerebellar external germinal layer (EGL). Using microdissection in combination with fluorescent-activated cell sorting (FACS), a pure population of NEPs was collected separately from conventional granule neuron precursors in the EGL and from other contaminating Nestin-expressing cells in the cerebellum. Without microdissection, functional analyses of NEPs would not have been possible with the current methods available, such as Percoll gradient centrifugation and laser capture microdissection. This technique can also be applied for use with various tissues that contain either recognizable regions or fluorescently-labeled cells. Most importantly, a major advantage of this microdissection technique is that isolated cells are living and can be cultured for further experimentation, which is currently not possible with other described methods.

Nestin-expressing&#160;progenitors are a newly identified population of neuronal progenitors in the developing cerebellum. Using the microdissection technique presented here in combination with fluorescent-activated cell sorting, this cell population can be purified with no contamination from other cerebellar regions and can be cultured for further studies.

Isolation von unterschiedlichen Zellpopulationen aus sich entwickelnden Kleinhirn durch Mikrodissektion

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

In-vitro- Charakterisierung der elektrophysiologischen Eigenschaften des Kolon afferenten Fasern in Ratten

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...