Die kleine Kolonievariante oder SCV-Technik ermöglicht die Auswahl und das Wachstum kleiner Kolonievarianten von Pseudomonas aeruginosa. Die Methode ist sehr definitiv und ermöglicht eine einfachere Auswahl als normale Methoden. Dieses Protokoll beschreibt auch eine sicherere, empfindlichere ELISA-Methode zur Alginatquantifizierung im Vergleich zur Standard-Uronsäure-Carbazol-Methode, die eine direkte Alginatquantifizierung in Proben ohne Kautery oder Probenmanipulation ermöglicht.
Das Verfahren wird Brandon Kirby, ein Labortechniker, und Roy Al Ahmar, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Um die kleine Kolonievariante oder SCV zu erkennen, streift zuerst der P.aeruginosa-Stamm PAO1 Delta PYRD auf vorgewärmten PIA-Platten. Wachsen Sie die Stämme bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden.
Identifizieren Sie auf der Wachstumsplatte ein einzelnes Kolonieisolat, das den SCV-Phänotyp hat, der sich durch eine Koloniegröße von ein bis drei Millimetern im Gegensatz zur normalen Koloniegröße von drei bis fünf Millimetern auszeichnet. Die ausgewählten Kolonien werden erneut entdeckt, um ein reines Isolat des SCV zu erhalten. Um die physiologische Aktivierung des Bergungswegs durchzuführen, verwenden Sie eine sterile Impfschleife, um die SCV-Kolonie aus der PIA-Platte zu wählen.
Streichen Sie die ausgewählte Kolonie auf einer vorgewärmten PIA-Platte, ergänzt mit 0,1 Millimolar Uracil. Wachsen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden. Um den Uronsäure-Carbazol-Test zu beginnen, identifizieren Sie eine einzelne Kolonie aus einer reinen Kultur der gewünschten Sorte, die getestet werden soll, und wählen Sie die Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher.
Legen Sie den Zahnstocher in ein Kultur-Reagenzglas mit fünf MilliliterPIB. Wachsen Sie in einem Shaker-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Nach der Inkubation ein Aliquot der kultivierten PIB-Brühe auf eine vorgewärmte PIA-Platte geben.
Mit einem sterilen Zellstreuer, verteilen Sie die Brühe über den Teller und wachsen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Mit einem Pipettenregler und einer sterilen 50-Milliliter-Pipette 0,85% Natriumchlorid auf den erwachsenen Rasen geben und die Probe sammeln, indem sie die Platte mit einem Zellstreuer kratzen. Die Probe mit einer frischen 50-Milliliter-Pipette ansaugen und in ein 50-Milliliter-Sammelrohr geben.
Wirbeln Sie die Probe auf hoch zu mischen und legen Sie die Proben auf Eis. Um die OD600 der Proben zu messen, leeren Sie zunächst das Spektralphotometer mit einem Milliliter 0,85% Natriumchlorid. Dann fügen Sie einen Milliliter der Probe zu einer neuen Einweg-Küvette und lesen Sie die OD. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um eine Dreifache der Lesevorgänge für jedes Beispiel zu erhalten.
Nun drei Milliliter der Schwefelsäureboratlösung in Kulturröhren geben und auf Eis sitzen lassen. 350 Mikroliter der gesammelten Probe langsam in die Säuremischung in den Reagenzgläsern geben. Nach einem kurzen Wirbeln auf niedrigem Niveau 100 Mikroliter 0,1% Carbazol und Ethanollösung in das Säureprobengemisch geben.
Kappen Sie das Rohr und den Wirbel für fünf Sekunden auf der Medium-Einstellung. Dann in einem trockenen Bad bei 55 Grad Celsius für 30 Minuten. Nach der Inkubation die Rohre kurz auf hoch wirbeln und fünf Minuten abkühlen lassen.
Verwenden Sie das Rohr mit 0,85% Natriumchlorid als Rohling zum Spektralphotometer. Dann einen Milliliter der Mischung zu einer sauberen Küvette geben und die OD der Proben bei 530 Nanometern auf einem Spektralphotometer lesen. Bereiten Sie eine Standardkurve vor, indem Sie die OD530 der seriellen Verdünnungen bekannter Konzentrationen von d-Mannuronsäure messen.
Wiederholen Sie dies zweimal, und extrahieren Sie eine lineare Gleichung aus diesen Messwerten. Berechnen Sie die Konzentration des Alginats in jeder Probe unter Verwendung der Standardkurve und teilen Sie die Alginatkonzentration aus der linearen Gleichung durch OD600 auf, um die Gesamtmenge an Alginat pro OD600 zu erhalten. Mit einer Mikropipette 50 Mikroliter der gesammelten Probe zu einer unbehandelten 96-Well-Platte hinzufügen.
Dann 50 Mikroliter ELISA-Beschichtungspuffer in die Brunnen geben. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Mit einer Spritzflasche die Plattenbrunnen zweimal mit PBS-T waschen, indem Sie die Brunnen füllen und dann entleeren, indem Sie die Platte umdrehen.
200 Mikroliter Sperrpuffer mit einer Mikropipette in die Brunnen geben und über Nacht bei vier Grad Celsius brüten. Am nächsten Tag den Teller zweimal wie bisher mit PBS-T waschen. Dann 100 Mikroliter verdünnter Primärantikörper in die Brunnen geben und bei 37 Grad Celsius ein bis zwei Stunden brüten.
Nach der Inkubation die Plattenbrunnen dreimal wie bisher mit PBS-T waschen. Als nächstes 100 Mikroliter verdünnter Sekundärantikörper in die Brunnen geben und bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Stunden brüten. Nachdem Sie die Platte dreimal wieder gewaschen haben, verwenden Sie eine Mikropipette, um 100 Mikroliter TMB ELISA-Lösung hinzuzufügen.
Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln, indem Sie die Platte in eine Schublade legen oder in Folie wickeln. Dann 100 Mikroliter Stop-Lösung hinzufügen. Verwenden Sie einen Plattenleser, um die OD bei 450 Nanometern zu messen.
Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie die OD450 der seriellen Verdünnungen bekannter Konzentrationen von d-Mannuronsäure messen. Wiederholen Sie die Messungen zweimal, und extrahieren Sie eine lineare Gleichung. Berechnen Sie die Konzentration des Alginats in jeder Probe mit der Standardkurve und teilen Sie die Alginatkonzentration aus der linearen Gleichung durch OD600 auf, um die Gesamtmenge an Alginat pro OD600 zu erhalten.
Gezeigt werden hier Proben von PAO581 und PAO581 mit Mutationen in Genen, die Pyrimidin de Novo Biosynthese regulieren, die auf PIA angebaut werden, und PIA, ergänzt mit 0,1 Millimolar Uracil. Die Daten zeigen, dass das Vorhandensein von Uracil in den Medien zur Umwandlung des mutierten Stammes zurück in die Schleimhaut führt, wie die wiederhergestellte Alginatproduktion zeigt. Hier werden Ergebnisse für den monoklonalen Antikörper-basierten Antikörper-basierten Antikörper-Basierten ELISA gezeigt.
Kolonien werden auf PIA-Platten mit Arabinose zur Induktion des PBAD-Promotors und des pHERD-20T-Plasmids angebaut. Gezeigt werden PAO1, PAO1 mit dem Expressionplasmid pHERD-20T mit dem wichtigsten Alginat-spezifischen Sigma-Faktor AlgU und PAO1 mit einer In-Frame-Deletion des AlgD-Gens bei der Codierung des wichtigsten Alginat-Biosyntheseenzyms GDP-Mannose-Dehydrogenase. Diese Daten vergleichen die nicht-mukoiden Alginatspiegel, gemessen für PAO1 und PAO1 Delta algD, mit den für PAO1 gemessenen Alginat-Mukoid-Spiegeln mit pHERD-20T algU.
Antialginat-ELISA wurde auch an Patienten-Sputum-Proben ohne vorheriges Wachstum auf Platten getestet. Drei CF-Sputumproben mit einem Wachstum von Mukoid P.aeruginosa zeigten nachweisbares Alginat im Vergleich zu zwei Patienten-Sputumproben, die entweder nicht-mukoid P.aeruginosa oder kein P.aeruginosa-Wachstum enthielten. Die Vorbereitung der Standardkurven für die Alginatquantifizierung ist sehr wichtig, da dies eine präzise und genaue Messung von Alginat innerhalb der Probe ermöglicht.
Die säurehaltige Lösung, die in der Carbazol-Methode verwendet wird, ist sehr gefährlich, so dass die richtige persönliche Schutzausrüstung und Vorsichtsmaßnahmen verwendet werden müssen, um die Sicherheit zu gewährleisten. Nach der Isolierung von SCVs kann eine weitere genetische Profilierung durchgeführt werden, um auftretende Mutationen und die pathogene Ität, die mit solchen Mutationen verbunden ist, besser zu verstehen. Die ELISA-Methode kann angepasst werden, um chronische Lungeninfektionen bei Patienten mit Mukoviszidose zu überwachen.
Darüber hinaus könnte unsere Wachstumsmethode helfen, Infektionen zu diagnostizieren, die durch bestimmte ScVs verursacht werden.
