Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Institutes of Health (RO1 GM079351, DK). Wir danken für ihre hilfreichen Ratschläge auf pupal Eierstock Sezierungen basierend auf ihrem ursprünglichen Protokoll Dorothea Godt. Wir danken auch Amy Reilein für ihre Hilfe und Kommentare auf das Manuskript.

(1) EggLaying
<ol><li>Kombinieren Sie etwa zehn männlichen und 15 weiblichen Erwachsenen Drosophila -fliegen des gewünschten Genotyps in ein Fläschchen mit normalen reichen fliegen Lebensmittel mit Hefe ergänzt. Um zu vermeiden, Überbelegung der Durchstechflasche, ermöglichen Sie begatteten Weibchen zur Eiablage nicht länger als 2 – 4 h14.</li>
	<li>Übertragen Sie die Erwachsenen aus dem Fläschchen in ein neues Fläschchen durch Tippen auf das Fläschchen öffnen gegen ein anderes Fläschchen mit fliegen Essen. Lassen Sie die Eiern, Larven bei Raumtemperatur für 3 – 4 Tage zu entwickeln.</li>
</ol>2. Auswahl der weiblichen Larven
<ol><li>Mit einem feuchten feinen Pinsel mit weichen Borsten, machen Sie eine rollende Bewegung mit dem Pinsel entlang der Wand des Röhrchens, wandernde dritte Instar Larven aus dem Fläschchen auf ein Glas gut gefüllt bis zum Rand mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu übertragen. Waschen Sie die Speisereste aus den Larven, indem Sie sie zu einem anderen gut gefüllt mit 1 X PBS übertragen.</li>
	<li>Die männlichen und weiblichen Larven mit Pinzette zu trennen. Identifizieren Sie die männlichen Larven durch ein paar große, Runde und transluzenten Hoden eingebettet in Fett Körper an der lateralen Seite des Körpers etwa zwei Drittel nach unten aus seiner vorderen Ende15. Weiblichen Larven sind durchschnittlich größer, weniger transparent als die Männchen und haben viel kleinere Gonaden, die schwieriger zu erkennen sind.</li>
	<li>Wählen Sie gegen männliche Larven, weiblichen Larven zu sammeln. Sammeln Sie mindestens zehn Frauen aus dem Brunnen. Legen Sie die weiblichen Larven in einem separaten, gut gefüllt mit 1 X PBS.</li>
	<li>Mit Hefe ergänzt Verwendung Zangen, die weiblichen Larven sanft in ein neues Fläschchen Fliege Frischkost zu übertragen.</li>
	<li>Platzieren Sie das Fläschchen mit den weiblichen Larven an einem dunklen Ort, Pupariation16zu erleichtern. Im Laufe des Tages überwachen Sie die Larven für Pupariation. Da jede Larve lähmt und entwickelt sich zu einem Prepupa, Kreis Prepupa gegen das Fläschchen und notieren Sie die ungefähre Zeit wenn es zuerst in ein Prepupa bildet. Prepupae durch die Vorwölbung des vorderen Luftlöcher und Timing der Puppenkammer Bildung17zu identifizieren. Lassen Sie die Prepupae, um den gewünschten Zeitpunkt (gemessen in Stunden nach Puppenkammer Bildung, APF) zu entwickeln. Hinweis: Jedes Tier, das Puppenkammer Bildung innerhalb eines ca. 10 h Intervalls unterziehen kann ein Prepupa betrachtet werden. Das Puppenstadium beginnt ca. 12 h nach der Puppenkammer Bildung nach einer internen Häutung stattgefunden hat.</li>
</ol>3. Vorbereitung Puppen Antikörper Färbung
<ol><li>
Bilden Sie ein dünnes Glas Pipettieren in späteren Schritten verwendet werden, für die pupal fetten Körper ausräumen.
	<ol>
<li>Schmelzen Sie die Glas-Tipp von einem Pasteur Pipettieren bei einem Bunsenbrenner. Als das Glas schmilzt, verwenden Sie Zange um die Spitze horizontal Weg vom Rest des Pipettieren eine dünnere Spitze bilden ziehen.</li>
		<li>Nach dem Abkühlen, brechen Sie einen kleinen Teil der Pipettieren Spitze, eine nette Runde Öffnung zu bilden. Legen Sie eine Glühbirne an das andere Ende der pipettieren.</li>
		<li>Laden Sie das Pipettieren mit 1 X PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um die Puppen zu ernten, die an der Wand des Röhrchens geklebt sind, wenden Sie einen kleinen Tropfen des Wassers entlang der Kontaktzone zwischen Puppe und Fläschchen. 1 – 2 min. warten, bis das Protein lassen Kleber auflösen bevor Sie die Puppe von der Wand mit einem feuchten, feinen Pinsel sanft anheben. Die Puppe mit einem Glas gut gefüllt mit 1 X PBS zu übertragen. Einen einzigen Brunnen pro Puppe zu vermeiden Überbelegung des Brunnens zu widmen.</li>
	<li>Während das hintere Ende der Puppe mit einem paar der Zange greifen, reißen Sie den vorderen Teil der pupal Fall mit einem anderen paar vorsichtig bis der Kopf der Puppe sichtbar ist.</li>
	<li>Greifen Sie anterior-die meisten Tipp des pupal Kopfes mit einer Pinzette und ziehen Sie vorsichtig die Puppe aus ihrer pupal Fall. Hinweis: Ein Teil des Körpers Fett kann während dieses Vorgangs ergießen.</li>
	<li>Trennen und entsorgen der vorderen Hälfte der Puppe aus der hinteren Hälfte, bis nur der Bauch Plünderung übrig bleibt.</li>
	<li>
Der Bauch Plünderung entziehen Sie die Zellen Fett.
	<ol>
<li>Erfassen der Abdominal-Plünderung gegen die Unterseite des Brunnens mit Zange in der Hand halten Sie das Dünnglas Pipettieren mit 1 X PBS in einer anderen Hand gefüllt.</li>
		<li>Ziel ist die dünne Pipettieren Spitze in Richtung der Öffnung der Sack und langsam Pipettieren 1 X PBS in den Bauch der fetten Körperzellen umgebenden pupal Eierstöcke abzuwaschen. Hinweis: Die Eierstöcke sind ein paar klein, lichtdurchlässig, gestreift und längliche Strukturen, die im Inneren der Abdominal-Plünderung bleiben sollten.</li>
		<li>Waschen Sie ab, die fetten Körper Zellen bis mindestens zwei Drittel des Körpers Fett ist Weg oder die Eierstöcke nahe der Öffnung der Abdominal-Sack sichtbar sind. Es ist sehr wichtig, diesen Schritt langsam ausführen um nicht die Eierstöcke aus dem Bauch durch Zufall zu waschen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prüfen Sie den Brunnen zu überprüfen, ob die Eierstöcke während der Zelle Fett Duschgel heraus verschüttet haben. Wenn die Eierstöcke nicht sichtbar innerhalb des Brunnens sind, sollten sie im Bauch geblieben sind. Wenn die Eierstöcke herausgekommen sind, legen Sie eine neue Puppe in den Brunnen und wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
	<li>Übertragen Sie den Bauch in eine klare Deckglas Kammer gefüllt mit Fixierung-Puffer (1 X PBS, 4 % Paraformaldehyd) und setzen Sie den Deckel an der Spitze. Um zu gewährleisten eine ausreichende Anzahl von Eierstöcken widerstehen Färbung und Montageprozess, sezieren mehr Eierstöcke als nötig. Achtung: Die Fixierung Puffer enthält Paraformaldehyd, die giftig ist. Bitte tragen Sie geeignete Schutzmaßnahmen wie Handschuhe, Schutzbrille, etc..</li>
</ol>4. Immunhistochemie
<ol><li>Während der gesamten Färbung verwenden Sie Zange, um drücken Sie vorsichtig alle schwimmenden Eierstöcke an der Unterseite des Brunnens Deckglas um sicherzustellen, dass die Eierstöcke komplett in Antikörperlösung eingetaucht sind.</li>
	<li>Ortund Streifen doppelseitiges Klebeband auf die flache Oberfläche des einen Nutator, dann legen die gekammerten Deckglas auf der Klebefläche.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eierstöcke im Fixierung Buffer Schritt 3.7 für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Spülen Sie die Eierstöcke dreimal in 1 X PBS mit 1 % Triton x-100 für 5, 10 und 45 min (1 h insgesamt), bzw. um gründliche Permeabilisierung zu ermöglichen.</li>
	<li>Blockieren die Eierstöcke bei 10 % normalem Ziegenserum mit 1 X PBS-Puffer mit 0,5 % Triton x-100 für 30 Minuten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eierstöcke über Nacht in 600 µL Primärantikörper Wahl verdünnt, um die entsprechende Konzentration in 1 X PBS mit 0,5 % Triton x-100 bei 4 ° C.</li>
	<li>Spülen Sie die Eierstöcke drei Mal für 5 min mit 1 X PBS-Puffer mit 0,5 % Triton x-100.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eierstöcke für 2 h in 600 µL Sekundärantikörper Wahl auf die entsprechende Konzentration in 1 X PBS mit 0,5 % Triton x-100 bei Raumtemperatur verdünnt.</li>
	<li>Spülen Sie die Eierstöcke zweimal für 5 min mit 1 X PBS-Puffer mit 0,5 % Triton x-100 und einmal für 5 min in 1 X PBS.</li>
</ol>5. zerlegen und montieren Pupal Eierstöcke
<ol><li>Geben Sie einen kleinen Tropfen 1 X PBS auf einen Objektträger. Verwendung Zange übertragen der Abdominal-Plünderung von den Kammern Deckglas auf ein Glas gut gefüllt mit 1 X PBS. Einen einzigen Brunnen pro Puppe zu vermeiden Überbelegung des Brunnens zu widmen.</li>
	<li>Zerreißen der Abdominal-Plünderung und alle restlichen Fett mit der Pinzette. Hinweis: Die Eierstöcke, die ein paar klein, lichtdurchlässig, gestreift und längliche Strukturen sind, sollten innerhalb des Brunnens sichtbar. Die Eierstöcke sind oft eng von den fetten Körper umgeben, so ist es wichtig, dass alle fetten Körper ist gründlich zerrissen auseinander.</li>
	<li>Übertragen Sie die Eierstöcke aus dem Brunnen in den Tropfen 1 x PBS am Mikroskop schieben Sie durch das Zentrum der Eierstöcke zwischen den Spitzen der Zange greifen. Es ist sehr wichtig, einen festen Griff ohne zu quetschen die Eierstöcke zu verwenden, um nicht zu verlieren oder zerstören sie während der Übertragung. Fügen Sie ein paar Tropfen 1 X PBS zur Folie hinzu, wenn die Lösung im Laufe der Zeit austrocknet.</li>
	<li>Sobald alle Eierstöcke seziert und auf den Objektträger Pipettieren 40 µL Eindeckmedium auf einem Ort das Deckglas vorsichtig auf die Eierstöcke und 22 x 22 mm Deckglas übertragen wurden. Lassen Sie die Folie über Nacht trocknen vor der Bildgebung.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Stem+Cell+Niches:+A+Decade+of+Discovery+Suggests+a+United+View+of+Stem+Cell+Regulation.">Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation.</a> Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li><li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ovary:+an+active+stem+cell+community.">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).</li><li>Dansereau, D. A., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+Germline+Stem+Cells+in+Drosophila.">The Development of Germline Stem Cells in Drosophila.</a> Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).</li><li>Pearson, J., L&#243;pez-Onieva, L., Rojas-R&#237;os, P., Gonz&#225;les-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+Drosophila+stem+cell+biology.">Recent advances in Drosophila stem cell biology.</a> Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).</li><li>Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. 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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+myeloid+leukemia:+proving+ground+for+cancer+stem+cells.">Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells.</a> Cell. 119 (3), 314-316 (2004).</li><li>Reilein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+direct+stem+cell+derivatives+defined+by+stem+cell+location+and+graded+Wnt+signaling.">Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling.</a> Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).</li><li>Eliazer, S., Buszczack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+niche:+studies+from+the+Drosophila+ovary.">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).</li><li>Godt, D., Laski, F. 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K., Aggarwal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+female+Drosophila+reproductive+system.">The development of the female Drosophila reproductive system.</a> J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).</li><li>Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pak-regulated+cell+intercalation+event+leading+to+a+novel+radial+cell+polarity+is+involved+in+positioning+of+the+follicle+stem+cell+niche+in+the+Drosophila+ovary.">A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary.</a> Development. 142 (1), 82-91 (2015).</li><li>Irizarry, J., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+supports+Drosophila+fertility+by+regulating+development+of+ovarian+muscle+tissues.">FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues.</a> Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).</li><li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Staining+of+Drosophila+Larval+Ovaries.">Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries.</a> J Vis Exp. (51), e2537 (2011).</li><li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+the+Gonads+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER.">The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).</li><li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li><li>Courdec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bric+&#224;+brac+locus+consists+of+two+paralagous+genes+encoding+BTB/POZ+domain+proteins+and+acts+as+a+homeotic+and+morphogenetic+regulator+of+imaginal+development+in+Drosophila.">The bric &#224; brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila.</a> Development. 129, 2419-2433 (2002).</li><li>Arrese, E. L., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INSECT+FAT+BODY:+ENERGY,+METABOLISM,+AND+REGULATION.">INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION.</a> Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).</li><li>Zhang, Y., Xi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+Body+Development+and+its+Function+in+Energy+Storage+and+Nutrient+Sensing+in+Drosophila+melanogaster.">Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster.</a> J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).</li><li>Wong, L. C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Drosophila+Ovaries.">Dissection of Drosophila Ovaries.</a> J Vis Exp. (1), e52 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Der kritische und schwierige Schritt dieses Protokolls beinhaltet die Vorbereitung der pupal Eierstöcke vor der Fixierung. Um sicherzustellen, dass die Eierstöcke, kleine und begraben durch Fett Körperzellen in den pupal Bauch ausreichend mit Antikörpern gefärbt sind, ist es wichtig, nicht nur eine große Öffnung in der abdominalen Plünderung mit der Pinzette zu reißen, sondern auch extrahieren die fetten Körperzellen, die behindern die Eierstöcke aus der Antikörper. Erfolgreiche Durchführung dieses Schritts ...

Stammzellenforschung mit Drosophila Eierstöcke hat seit der ersten Dokumentation einer Stammzelle Nische1,2,3,4weit ausgebaut. Nach der Entwicklung der Linie Ablaufverfolgung genetische Werkzeuge, Drosophila Eierstock, die Sezierungen häufig verwendet wurden, um die Stammzell-Linien zu studieren und Signalwege, die Stammzell-Wartung, Verbreitung und Schicksal in der Stammzellnische regulieren. Kenntnisse über diese Signalwege kann Einblicke in mögliche Ursachen von Krebserkrankungen hervorbringen, die von aberranten Stammzell-Aktivität5,6,7stammen. Es hat auch vor kurzem gezeigt, dass somatische Stammzellen im Eierstock Drosophila , bekannt als follikelstimulierendes Stammzellen (FSCs), stark Säugetier-intestinale Stammzellen in vielerlei Hinsicht von ihrer Organisation8ähneln. Aus diesem Grund sind Drosophila Eierstöcke sehr nützlich Modellsystem für Stammzell-Verhalten zu studieren.
Während Larven und Erwachsenen Eierstöcke bzw. Hinweise auf frühe Stammzell-Entwicklung und endgültige Stammzell-Organisation in der Nische bieten, ist die pupal Eierstock eine Zwischenkonstruktion in die Keimbahn und somatischen Zellen zu reorganisieren und ihre Identitäten zu schaffen 9 , 10. Obwohl mehrere Studien Aspekte der Gewebeentwicklung in den pupal Eierstock10,11,12,13 untersucht, bleiben Fragen hinsichtlich der Differenzierung und der räumlichen Organisation der Eierstock Zelltypen während der pupal Entwicklung. Insbesondere erfolgt die Spezifikation des FSCs in diesem Zeitraum. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für sezieren und Färbung pupal Eierstöcke zu gewünschten Zeitpunkten – eine Technik, die in Zeit Kurs Experimente verwendet werden kann, die pupal Eierstock Entwicklung im Detail von den Larven zu Erwachsenen Stadium zu analysieren.
Um die geringe Größe, Transluzenz und Unzugänglichkeit des pupal Eierstocks innerhalb pupal Abdomen berücksichtigen, nutzt dieses Protokoll-Tools wie eine maßgeschneiderte dünne Spitze Pasteur pipettieren, Abdominal-Fett Körpergewebe behindern Antikörper Zugang zu entfernen die Eierstöcke. Eine klare, gekammerten Deckglas verwendet, während die Antikörper Färbung bietet größere Sichtbarkeit der Puppen und ein sanfter Plattform für Schaukeln die Eierstöcke auf eine "Nutator." Basierend auf ein Protokoll für die Larven Eierstock Sezierungen von Maimon und Gilboa14, eine relativ hohe Konzentration von Triton x-100 noch beschäftigt waren bei den ersten Schritten der Färbeverfahren Zellmembran Permeabilisierung und Antikörper Zugang zu maximieren die Eierstockkrebs Zellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps, biology</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-10A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 Depression Glass Spot Plates</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet bulb</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm glass coverslips No 1</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine brush #0, #3-#5</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman Starter Kit</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F167300</td>
			<td>Contains p20, p200, p1000 pipettors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>Dilute to 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>5000121</td>
			<td>Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000)</td>
			<td>Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore)</td>
			<td></td>
			<td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum)</td>
			<td>Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly vials</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>V9406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Balls, For Wide Vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>51-102W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast, Bakers Dried Active</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>101400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly food</td>
			<td>Produced in laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Mixture of water, brewer&#39;s yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and staining of drosophila pupal ovaries

Im Gegensatz zu Erwachsenen Drosophila Eierstöcke pupal Eierstöcke sind relativ schwierig zu untersuchen, aufgrund ihrer geringen Größe, Transluzenz und einem pupal Fall umschließt. Die Herausforderung sezieren pupal Eierstöcke liegt auch in ihrem physischen Standort innerhalb der Puppe: die Eierstöcke sind umgeben von Fetten Körperzellen innerhalb der pupal Abdomen, und diese Fettzellen entleert werden, um korrekte Antikörper Färbung zu ermöglichen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, nutzt dieses Protokolls angepasste Pasteur Mehrkanalpipette um Fett Körperzellen vom pupal Abdomen zu extrahieren. Darüber hinaus einer gekammerten Deckglas anstelle von einem Microcentrifuge Schlauch bei der Färbung dient zur Verbesserung der Sichtbarkeit der Puppen. Trotz dieser und andere Vorteile der in diesem Protokoll verwendeten Werkzeuge, kann erfolgreiche Durchführung dieser Techniken noch mehrere Tage der Praxis aufgrund der geringen Größe der pupal Eierstöcke beinhalten. In diesem Protokoll beschriebenen Techniken könnte zur Zeit Kurs Experimente gelten in denen Eierstöcke in verschiedenen Entwicklungsstadien pupal analysiert werden.

Erfolgreiche Ausführung dieser Prozedur sollte führen klar Antikörper Färbung, die die Struktur und die zelluläre Organisation eine Drosophila pupal Eierstock offenbart. Immunohistochemistry dieses Protokolls lässt sich Zelltypen häufig gebeizt in Larven und Erwachsenen Eierstöcke zu identifizieren. Zellen des pupal Stiels abgeleitet Schwarm Zellen18 (beschrieben von Fasciclin III in weiß) sind in Abbildung 3dargestel...

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Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Drosophila Eierstock ist ein hervorragendes Modell für Stammzell-Nische Entwicklung zu studieren. Obwohl Methoden für die Larven und adulten Eierstöcke sezieren veröffentlicht wurden, erfordern pupal Eierstock Sezierungen verschiedene Techniken, die nicht im Detail veröffentlicht wurden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum sezieren, Beizen und Montage pupal Eierstöcke.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

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Serie: Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-Bilder aus dem<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Augen

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

Dissection von Larval Zebrabärbling Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissektion und Kultur der Maus Embryonale Niere

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

Eine schnelle und effiziente Methode, um Pupal Flügel von Drosophila geeignet für Immunodetections oder PCR-Assays sezieren

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Dissektion der Drosophila Pupal Netzhaut Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Auftauen, Kultivierung und Cryopreserving Drosophila -Zell-Linien

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

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