Name: dissection and staining of drosophila pupal ovaries
Uploaded: 2018-03-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
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Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Institutes of Health (RO1 GM079351, DK). Wir danken für ihre hilfreichen Ratschläge auf pupal Eierstock Sezierungen basierend auf ihrem ursprünglichen Protokoll Dorothea Godt. Wir danken auch Amy Reilein für ihre Hilfe und Kommentare auf das Manuskript.

(1) EggLaying
<ol><li>Kombinieren Sie etwa zehn männlichen und 15 weiblichen Erwachsenen Drosophila -fliegen des gewünschten Genotyps in ein Fläschchen mit normalen reichen fliegen Lebensmittel mit Hefe ergänzt. Um zu vermeiden, Überbelegung der Durchstechflasche, ermöglichen Sie begatteten Weibchen zur Eiablage nicht länger als 2 – 4 h14.</li>
	<li>Übertragen Sie die Erwachsenen aus dem Fläschchen in ein neues Fläschchen durch Tippen auf das Fläschchen öffnen gegen ein anderes Fläschchen mit fliegen Essen. Lassen Sie die Eiern, Larven bei Raumtemperatur für 3 – 4 Tage zu entwickeln.</li>
</ol>2. Auswahl der weiblichen Larven
<ol><li>Mit einem feuchten feinen Pinsel mit weichen Borsten, machen Sie eine rollende Bewegung mit dem Pinsel entlang der Wand des Röhrchens, wandernde dritte Instar Larven aus dem Fläschchen auf ein Glas gut gefüllt bis zum Rand mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu übertragen. Waschen Sie die Speisereste aus den Larven, indem Sie sie zu einem anderen gut gefüllt mit 1 X PBS übertragen.</li>
	<li>Die männlichen und weiblichen Larven mit Pinzette zu trennen. Identifizieren Sie die männlichen Larven durch ein paar große, Runde und transluzenten Hoden eingebettet in Fett Körper an der lateralen Seite des Körpers etwa zwei Drittel nach unten aus seiner vorderen Ende15. Weiblichen Larven sind durchschnittlich größer, weniger transparent als die Männchen und haben viel kleinere Gonaden, die schwieriger zu erkennen sind.</li>
	<li>Wählen Sie gegen männliche Larven, weiblichen Larven zu sammeln. Sammeln Sie mindestens zehn Frauen aus dem Brunnen. Legen Sie die weiblichen Larven in einem separaten, gut gefüllt mit 1 X PBS.</li>
	<li>Mit Hefe ergänzt Verwendung Zangen, die weiblichen Larven sanft in ein neues Fläschchen Fliege Frischkost zu übertragen.</li>
	<li>Platzieren Sie das Fläschchen mit den weiblichen Larven an einem dunklen Ort, Pupariation16zu erleichtern. Im Laufe des Tages überwachen Sie die Larven für Pupariation. Da jede Larve lähmt und entwickelt sich zu einem Prepupa, Kreis Prepupa gegen das Fläschchen und notieren Sie die ungefähre Zeit wenn es zuerst in ein Prepupa bildet. Prepupae durch die Vorwölbung des vorderen Luftlöcher und Timing der Puppenkammer Bildung17zu identifizieren. Lassen Sie die Prepupae, um den gewünschten Zeitpunkt (gemessen in Stunden nach Puppenkammer Bildung, APF) zu entwickeln. Hinweis: Jedes Tier, das Puppenkammer Bildung innerhalb eines ca. 10 h Intervalls unterziehen kann ein Prepupa betrachtet werden. Das Puppenstadium beginnt ca. 12 h nach der Puppenkammer Bildung nach einer internen Häutung stattgefunden hat.</li>
</ol>3. Vorbereitung Puppen Antikörper Färbung
<ol><li>
Bilden Sie ein dünnes Glas Pipettieren in späteren Schritten verwendet werden, für die pupal fetten Körper ausräumen.
	<ol>
<li>Schmelzen Sie die Glas-Tipp von einem Pasteur Pipettieren bei einem Bunsenbrenner. Als das Glas schmilzt, verwenden Sie Zange um die Spitze horizontal Weg vom Rest des Pipettieren eine dünnere Spitze bilden ziehen.</li>
		<li>Nach dem Abkühlen, brechen Sie einen kleinen Teil der Pipettieren Spitze, eine nette Runde Öffnung zu bilden. Legen Sie eine Glühbirne an das andere Ende der pipettieren.</li>
		<li>Laden Sie das Pipettieren mit 1 X PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um die Puppen zu ernten, die an der Wand des Röhrchens geklebt sind, wenden Sie einen kleinen Tropfen des Wassers entlang der Kontaktzone zwischen Puppe und Fläschchen. 1 – 2 min. warten, bis das Protein lassen Kleber auflösen bevor Sie die Puppe von der Wand mit einem feuchten, feinen Pinsel sanft anheben. Die Puppe mit einem Glas gut gefüllt mit 1 X PBS zu übertragen. Einen einzigen Brunnen pro Puppe zu vermeiden Überbelegung des Brunnens zu widmen.</li>
	<li>Während das hintere Ende der Puppe mit einem paar der Zange greifen, reißen Sie den vorderen Teil der pupal Fall mit einem anderen paar vorsichtig bis der Kopf der Puppe sichtbar ist.</li>
	<li>Greifen Sie anterior-die meisten Tipp des pupal Kopfes mit einer Pinzette und ziehen Sie vorsichtig die Puppe aus ihrer pupal Fall. Hinweis: Ein Teil des Körpers Fett kann während dieses Vorgangs ergießen.</li>
	<li>Trennen und entsorgen der vorderen Hälfte der Puppe aus der hinteren Hälfte, bis nur der Bauch Plünderung übrig bleibt.</li>
	<li>
Der Bauch Plünderung entziehen Sie die Zellen Fett.
	<ol>
<li>Erfassen der Abdominal-Plünderung gegen die Unterseite des Brunnens mit Zange in der Hand halten Sie das Dünnglas Pipettieren mit 1 X PBS in einer anderen Hand gefüllt.</li>
		<li>Ziel ist die dünne Pipettieren Spitze in Richtung der Öffnung der Sack und langsam Pipettieren 1 X PBS in den Bauch der fetten Körperzellen umgebenden pupal Eierstöcke abzuwaschen. Hinweis: Die Eierstöcke sind ein paar klein, lichtdurchlässig, gestreift und längliche Strukturen, die im Inneren der Abdominal-Plünderung bleiben sollten.</li>
		<li>Waschen Sie ab, die fetten Körper Zellen bis mindestens zwei Drittel des Körpers Fett ist Weg oder die Eierstöcke nahe der Öffnung der Abdominal-Sack sichtbar sind. Es ist sehr wichtig, diesen Schritt langsam ausführen um nicht die Eierstöcke aus dem Bauch durch Zufall zu waschen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prüfen Sie den Brunnen zu überprüfen, ob die Eierstöcke während der Zelle Fett Duschgel heraus verschüttet haben. Wenn die Eierstöcke nicht sichtbar innerhalb des Brunnens sind, sollten sie im Bauch geblieben sind. Wenn die Eierstöcke herausgekommen sind, legen Sie eine neue Puppe in den Brunnen und wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
	<li>Übertragen Sie den Bauch in eine klare Deckglas Kammer gefüllt mit Fixierung-Puffer (1 X PBS, 4 % Paraformaldehyd) und setzen Sie den Deckel an der Spitze. Um zu gewährleisten eine ausreichende Anzahl von Eierstöcken widerstehen Färbung und Montageprozess, sezieren mehr Eierstöcke als nötig. Achtung: Die Fixierung Puffer enthält Paraformaldehyd, die giftig ist. Bitte tragen Sie geeignete Schutzmaßnahmen wie Handschuhe, Schutzbrille, etc..</li>
</ol>4. Immunhistochemie
<ol><li>Während der gesamten Färbung verwenden Sie Zange, um drücken Sie vorsichtig alle schwimmenden Eierstöcke an der Unterseite des Brunnens Deckglas um sicherzustellen, dass die Eierstöcke komplett in Antikörperlösung eingetaucht sind.</li>
	<li>Ortund Streifen doppelseitiges Klebeband auf die flache Oberfläche des einen Nutator, dann legen die gekammerten Deckglas auf der Klebefläche.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eierstöcke im Fixierung Buffer Schritt 3.7 für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Spülen Sie die Eierstöcke dreimal in 1 X PBS mit 1 % Triton x-100 für 5, 10 und 45 min (1 h insgesamt), bzw. um gründliche Permeabilisierung zu ermöglichen.</li>
	<li>Blockieren die Eierstöcke bei 10 % normalem Ziegenserum mit 1 X PBS-Puffer mit 0,5 % Triton x-100 für 30 Minuten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eierstöcke über Nacht in 600 µL Primärantikörper Wahl verdünnt, um die entsprechende Konzentration in 1 X PBS mit 0,5 % Triton x-100 bei 4 ° C.</li>
	<li>Spülen Sie die Eierstöcke drei Mal für 5 min mit 1 X PBS-Puffer mit 0,5 % Triton x-100.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eierstöcke für 2 h in 600 µL Sekundärantikörper Wahl auf die entsprechende Konzentration in 1 X PBS mit 0,5 % Triton x-100 bei Raumtemperatur verdünnt.</li>
	<li>Spülen Sie die Eierstöcke zweimal für 5 min mit 1 X PBS-Puffer mit 0,5 % Triton x-100 und einmal für 5 min in 1 X PBS.</li>
</ol>5. zerlegen und montieren Pupal Eierstöcke
<ol><li>Geben Sie einen kleinen Tropfen 1 X PBS auf einen Objektträger. Verwendung Zange übertragen der Abdominal-Plünderung von den Kammern Deckglas auf ein Glas gut gefüllt mit 1 X PBS. Einen einzigen Brunnen pro Puppe zu vermeiden Überbelegung des Brunnens zu widmen.</li>
	<li>Zerreißen der Abdominal-Plünderung und alle restlichen Fett mit der Pinzette. Hinweis: Die Eierstöcke, die ein paar klein, lichtdurchlässig, gestreift und längliche Strukturen sind, sollten innerhalb des Brunnens sichtbar. Die Eierstöcke sind oft eng von den fetten Körper umgeben, so ist es wichtig, dass alle fetten Körper ist gründlich zerrissen auseinander.</li>
	<li>Übertragen Sie die Eierstöcke aus dem Brunnen in den Tropfen 1 x PBS am Mikroskop schieben Sie durch das Zentrum der Eierstöcke zwischen den Spitzen der Zange greifen. Es ist sehr wichtig, einen festen Griff ohne zu quetschen die Eierstöcke zu verwenden, um nicht zu verlieren oder zerstören sie während der Übertragung. Fügen Sie ein paar Tropfen 1 X PBS zur Folie hinzu, wenn die Lösung im Laufe der Zeit austrocknet.</li>
	<li>Sobald alle Eierstöcke seziert und auf den Objektträger Pipettieren 40 µL Eindeckmedium auf einem Ort das Deckglas vorsichtig auf die Eierstöcke und 22 x 22 mm Deckglas übertragen wurden. Lassen Sie die Folie über Nacht trocknen vor der Bildgebung.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Stem+Cell+Niches:+A+Decade+of+Discovery+Suggests+a+United+View+of+Stem+Cell+Regulation.">Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation.</a> Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li><li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ovary:+an+active+stem+cell+community.">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).</li><li>Dansereau, D. 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L., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INSECT+FAT+BODY:+ENERGY,+METABOLISM,+AND+REGULATION.">INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION.</a> Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).</li><li>Zhang, Y., Xi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+Body+Development+and+its+Function+in+Energy+Storage+and+Nutrient+Sensing+in+Drosophila+melanogaster.">Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster.</a> J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).</li><li>Wong, L. C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Drosophila+Ovaries.">Dissection of Drosophila Ovaries.</a> J Vis Exp. (1), e52 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Der kritische und schwierige Schritt dieses Protokolls beinhaltet die Vorbereitung der pupal Eierstöcke vor der Fixierung. Um sicherzustellen, dass die Eierstöcke, kleine und begraben durch Fett Körperzellen in den pupal Bauch ausreichend mit Antikörpern gefärbt sind, ist es wichtig, nicht nur eine große Öffnung in der abdominalen Plünderung mit der Pinzette zu reißen, sondern auch extrahieren die fetten Körperzellen, die behindern die Eierstöcke aus der Antikörper. Erfolgreiche Durchführung dieses Schritts ...

Stammzellenforschung mit Drosophila Eierstöcke hat seit der ersten Dokumentation einer Stammzelle Nische1,2,3,4weit ausgebaut. Nach der Entwicklung der Linie Ablaufverfolgung genetische Werkzeuge, Drosophila Eierstock, die Sezierungen häufig verwendet wurden, um die Stammzell-Linien zu studieren und Signalwege, die Stammzell-Wartung, Verbreitung und Schicksal in der Stammzellnische regulieren. Kenntnisse über diese Signalwege kann Einblicke in mögliche Ursachen von Krebserkrankungen hervorbringen, die von aberranten Stammzell-Aktivität5,6,7stammen. Es hat auch vor kurzem gezeigt, dass somatische Stammzellen im Eierstock Drosophila , bekannt als follikelstimulierendes Stammzellen (FSCs), stark Säugetier-intestinale Stammzellen in vielerlei Hinsicht von ihrer Organisation8ähneln. Aus diesem Grund sind Drosophila Eierstöcke sehr nützlich Modellsystem für Stammzell-Verhalten zu studieren.
Während Larven und Erwachsenen Eierstöcke bzw. Hinweise auf frühe Stammzell-Entwicklung und endgültige Stammzell-Organisation in der Nische bieten, ist die pupal Eierstock eine Zwischenkonstruktion in die Keimbahn und somatischen Zellen zu reorganisieren und ihre Identitäten zu schaffen 9 , 10. Obwohl mehrere Studien Aspekte der Gewebeentwicklung in den pupal Eierstock10,11,12,13 untersucht, bleiben Fragen hinsichtlich der Differenzierung und der räumlichen Organisation der Eierstock Zelltypen während der pupal Entwicklung. Insbesondere erfolgt die Spezifikation des FSCs in diesem Zeitraum. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für sezieren und Färbung pupal Eierstöcke zu gewünschten Zeitpunkten – eine Technik, die in Zeit Kurs Experimente verwendet werden kann, die pupal Eierstock Entwicklung im Detail von den Larven zu Erwachsenen Stadium zu analysieren.
Um die geringe Größe, Transluzenz und Unzugänglichkeit des pupal Eierstocks innerhalb pupal Abdomen berücksichtigen, nutzt dieses Protokoll-Tools wie eine maßgeschneiderte dünne Spitze Pasteur pipettieren, Abdominal-Fett Körpergewebe behindern Antikörper Zugang zu entfernen die Eierstöcke. Eine klare, gekammerten Deckglas verwendet, während die Antikörper Färbung bietet größere Sichtbarkeit der Puppen und ein sanfter Plattform für Schaukeln die Eierstöcke auf eine "Nutator." Basierend auf ein Protokoll für die Larven Eierstock Sezierungen von Maimon und Gilboa14, eine relativ hohe Konzentration von Triton x-100 noch beschäftigt waren bei den ersten Schritten der Färbeverfahren Zellmembran Permeabilisierung und Antikörper Zugang zu maximieren die Eierstockkrebs Zellen.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Forceps, biology</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10A</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen</td><td></td></tr><tr><td>9 Depression Glass Spot Plates</td><td>Pyrex</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet bulb</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen burner</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm glass coverslips No 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine brush #0, #3-#5</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gilson Pipetman Starter Kit</td><td>Thomas Scientific</td><td>F167300</td><td>Contains p20, p200, p1000 pipettors</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td>Dilute to 1x PBS</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>5000121</td><td>Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000)</td><td>Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore)</td><td></td><td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum)</td><td>Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)</td><td></td><td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Fly vials</td><td>Denville Scientific</td><td>V9406</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Balls, For Wide Vials</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-102W</td><td></td></tr><tr><td>Yeast, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>101400</td><td></td></tr><tr><td>Fly food</td><td>Produced in laboratory</td><td></td><td>Mixture of water, brewer&#039;s yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid</td></tr><tr><td>Male and female &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and staining of drosophila pupal ovaries

Im Gegensatz zu Erwachsenen Drosophila Eierstöcke pupal Eierstöcke sind relativ schwierig zu untersuchen, aufgrund ihrer geringen Größe, Transluzenz und einem pupal Fall umschließt. Die Herausforderung sezieren pupal Eierstöcke liegt auch in ihrem physischen Standort innerhalb der Puppe: die Eierstöcke sind umgeben von Fetten Körperzellen innerhalb der pupal Abdomen, und diese Fettzellen entleert werden, um korrekte Antikörper Färbung zu ermöglichen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, nutzt dieses Protokolls angepasste Pasteur Mehrkanalpipette um Fett Körperzellen vom pupal Abdomen zu extrahieren. Darüber hinaus einer gekammerten Deckglas anstelle von einem Microcentrifuge Schlauch bei der Färbung dient zur Verbesserung der Sichtbarkeit der Puppen. Trotz dieser und andere Vorteile der in diesem Protokoll verwendeten Werkzeuge, kann erfolgreiche Durchführung dieser Techniken noch mehrere Tage der Praxis aufgrund der geringen Größe der pupal Eierstöcke beinhalten. In diesem Protokoll beschriebenen Techniken könnte zur Zeit Kurs Experimente gelten in denen Eierstöcke in verschiedenen Entwicklungsstadien pupal analysiert werden.

Erfolgreiche Ausführung dieser Prozedur sollte führen klar Antikörper Färbung, die die Struktur und die zelluläre Organisation eine Drosophila pupal Eierstock offenbart. Immunohistochemistry dieses Protokolls lässt sich Zelltypen häufig gebeizt in Larven und Erwachsenen Eierstöcke zu identifizieren. Zellen des pupal Stiels abgeleitet Schwarm Zellen18 (beschrieben von Fasciclin III in weiß) sind in Abbildung 3dargestel...

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Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Drosophila Eierstock ist ein hervorragendes Modell für Stammzell-Nische Entwicklung zu studieren. Obwohl Methoden für die Larven und adulten Eierstöcke sezieren veröffentlicht wurden, erfordern pupal Eierstock Sezierungen verschiedene Techniken, die nicht im Detail veröffentlicht wurden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum sezieren, Beizen und Montage pupal Eierstöcke.

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

9.3K Aufrufe.  Columbia University. Drosophila Eierstock ist ein hervorragendes Modell für Stammzell-Nische Entwicklung zu studieren. Obwohl Methoden für die Larven und adulten Eierstöcke sezieren veröffentlicht wurden, erfordern pupal Eierstock Sezierungen verschiedene Techniken, die nicht im Detail veröffentlicht wurden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum sezieren, Beizen und Montage pupal Eierstöcke.

Serie: Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection of Drosophila Ovaries

Dissection von Drosophila Ovarien

Forschung

Biologie

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Upright-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Entwicklungsbiologie

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

Visualisierung der Auswirkungen oxidativer Schäden auf Drosophila-Eierkammern mit Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection und Färbung von Drosophila Larven Ovarien

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in<em&gt; Drosophila</em&gt; Ovarien

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Dissektion und Lipid Tröpfchen Färbung von Oenocytes in Drosophila Larven

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Sezieren, Fixieren und Visualisieren der Drosophila pupal notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

Präparation und Färbung von Drosophila Pupal Eierstöcke

Zusammenfassung

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