Diese Methode der Oenocyte-Sektion und Lipid-Tröpfchen-Färbung kann verwendet werden, um das Auftreten von Lipidtröpfchen in drosophila larvae oenocyte unter normalen und gestressten Bedingungen zu realisieren. Diese Methode ist ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung des Fettstoffwechsels nicht nur bei Insekten, sondern auch bei Säugetieren mit nur wenigen geringfügigen Modifikationen. Um die Eiablage zu induzieren, legen Sie 150 jungfräuliche Weibchenfliegen und 75 Männchen der gewünschten Genotypen in eine Eierverlegeflasche und legen Sie die Flasche unter eine lichtdichte Box in einen 25 Grad Celsius Brutkasten mit 60% Luftfeuchtigkeit.
Nach einer Stunde die Fliegen in eine neue Flasche überführen und die Fliegen eine Stunde lang Eier in die neue Flasche legen lassen, bevor sie die Erwachsenen entfernen. Dann lassen Sie die Eier zu den dritten Instar Larven für 84 Stunden bei 25 Grad Celcius mit einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus entwickeln. Bevor Sie die Hungerbehandlung einbildnen, legen Sie ein entsprechend großes Stück Filterpapier in eine sechs Zentimeter lange Petrischale und fügen Sie einen Milliliter PBS auf das Papier, um eine Hungerkammer zu schaffen.
Um eine Kontrollbehandlungskammer zu machen, legen Sie fünf Milliliter Bloomington Standard-Maismehl-Lebensmittel in eine sechs Zentimeter lange Petrischale. Wenn die Kammern fertig sind, verwenden Sie einen kleinen Pinsel, um Instar-Larven der gleichen ungefähren Größe aus der Eierlegende Flasche zu sammeln. Und 20 Larven nach dem Zufallsprinzip in jeden Hunger und die Kontrollkammer.
Dann legen Sie die Kammern in den Inkubator für 12, 24 oder 36 Stunden Entwicklung und / oder Hunger. Am Ende der Behandlungszeit verwenden Sie Zangen, um Larven sanft aus jeder Kammer in eine Sezierplatte mit eiskaltem PBS zu übertragen und die Platte unter ein Stereomikroskop zu stellen. Richten Sie die erste Larven-Ventralseite nach oben und verwenden Sie Zangen, um die Larve sanft an Ort und Stelle zu halten.
Legen Sie einen Stift durch den Rachen und einen anderen Stift durch das Spirakel, um die Larve an der Platte zu befestigen. Verwenden Sie Vannas Federschere, um einen Längsschnitt durch die Epidermis vom vorderen bis zum hinteren Ende des Tieres zu machen. Verwenden Sie Zangen, um das innere Gewebe der Epidermis zu entfernen, wobei darauf zu achten ist, dass Schäden an den Oenozyten auf der inneren Oberfläche der Epidermis vermieden werden.
Verwenden Sie dann Zangen, um die Sezierstifte abzurufen und die Epidermis auf ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr von PBS auf Eis zu übertragen. Für die Lipidtröpfchenfärbung die sezierte Epidermis im Fixationspuffer 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator inkubieren, gefolgt von einer schnellen Resuspension in einem Milliliter PBS. Dann waschen Sie die Proben mit drei fünfminütigen Wäschen in einem Milliliter PBS pro Wäsche, um alle Restfixierungen zu entfernen.
Nach der letzten Wäsche die epidermalen Proben mit einer geeigneten lipophilen Sonde 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator inkubieren. Während der Inkubation die Probenröhrchen in Folie wickeln, um das Gewebe vor Licht zu schützen, und die Proben dreimal in einem Milliliter PBS für 10 Minuten pro Wäsche waschen. Um die Oenozyten abzubilden, übertragen Sie jede Epidermisprobe in sechs Mikroliter Montagemedium auf einem sauberen Mikroskopschlitten, passen Sie die Ausrichtung des Gewebes an, so dass die innere Oberfläche, die die Oenozyten enthält, den Boden des Dias berührt.
Legen Sie einen Deckelrutsch vorsichtig auf die Epidermis und versiegeln Sie die Kanten mit klarem Nagellack. Wenn die Politur getrocknet ist, stellen Sie die Proben auf ein konfokales Mikroskop, setzen Sie eine 63 X Vergrößerung mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionswellenlängen. Es gibt ein paar nachweisbare Lipidtröpfchen innerhalb der Oenozyten der normalen Fütterung larven in verschiedenen Entwicklungsstadien.
Wie in diesen repräsentativen Bildern beobachtet, nehmen die Lipidtröpfchen in den Oenozyten als Reaktion auf 12, 24 und 36-Stunden-Zeiträume des Hungers an. Diese Methode bietet und ein einfaches und ein praktikables Protokoll für Forscher in relevanten Forschungsbereichen, um zu untersuchen, ob genetische oder Umweltmanipulationen Lipidtröpfchenveränderungen in Zellen verursachen.
