Wir möchten Atsushi Miyawaki für uns mit der ratiometrische-PERICAM-mt Expressionskonstrukt danken. Diese Arbeit wurde durch Grant GM081685 von den National Institutes of Health (DB) unterstützt.

1. Pericam-mt Transfektion und Cell Preparation. <ol><li> Platte HeLa-Zellen der Nacht vor der Transfektion auf sterile Deckgläschen in einem Standard-6-well-Kulturplatte gelegt. </li><li> Bereiten DNA / Lipofectamine 2000 Komplexe, wie vom Hersteller (Invitrogen) vorgeschlagen. Wir verwenden 4 pg ratiometrische-PERICAM-mt Expressionsvektor und 10 ul Lipofectamine 2000 in 0,5 ml Opti-MEM für jedes Well verdünnt. Die Zellen sollten ~ 70% konfluent vor der Transfektion werden. </li><li> Ersetzen HeLa Kulturmedien (Dulbecco modifiziertem Eagles Medium, 10% FBS, Penicillin / Streptomycin) in jedes Well mit 1,5 ml des gleichen Medium ohne Antibiotika. </li><li> Fügen Sie die DNA / Lipofectamine Komplexe in jede Vertiefung zu transfiziert werden. Vorsichtig mischen mit Schaukeln und inkubieren für 4 Stunden in einer Zellkultur-Inkubator bei 37 o C, 5% CO 2. </li><li> Ersetzen Antibiotika-freien Medien mit Nährmedien mit Antibiotika. Lassen Zellen ratiometrische PERICAM für 1-2 Tage vor Imaging auszudrücken. </li></ol> 2. Mikroskop-Setup und Image Acquisition <ol><li> Legen Sie ein Deckglas mit HeLa-Zellen in einem geeigneten bildgebenden Kammer mit Imaging-Lösung: 107mm NaCl, 7,2 KCl, 1,2 mm MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 11,5 Glucose, 0,1% Rinderserumalbumin und 20 mM HEPES 7,2. Unser Labor verwendet die Attofluor Zellkammer von Invitrogen. Montieren Sie den Imaging-Kammer in einem inversen Mikroskop Bühne. </li><li> Finden Sie einen Bereich von Interesse mit einer oder mehreren Zellen, die ratiometrische PERICAM mit einem 40x (oder höher) Ölimmersionsobjektiv. Wir haben festgestellt, dass ratiometrische PERICAM weniger resistent gegenüber bei 380 nm Bleichen ist, und damit wir diese Wellenlänge, geeignete Zellen zu identifizieren. Für die Bilder in Abbildung 1 erworben wurde eine Nikon Superfluor 40X-Objektiv mit einem 1,3 numerische Apertur verwendet. Höhere Vergrößerung Ziele wäre auch angebracht (60-100x). Anregung Filter verwendet wurden Chroma Technology Filter D380/30x (380 + / - 30 nm) und D495/10 (495 + / - 5 nm), wurde Strahlteiler 505DCXR (505nm Langpass) und Emissions-Filter wurde HQ535/50m (535 + / - 25nm). Unser Mikroskop verwendet werden, um die Bilder in Abbildung 1 zu erwerben besteht aus einer Nikon TE2000 inversen Mikroskop mit einer Roper Scientific Coolsnap HQ gekühlte CCD-Kamera, Ludl MAC6000 schnelle Filterrad und-Wechsler und ein MetaFluor Datenerfassungs-und Analyse-Software ausgestattet. Dieses Protokoll kann auf jedem Standard-wide-field-Mikroskop mit den entsprechenden Filtern und Software in der Lage die Erfassung und Verarbeitung ratiometrische Bilder angepasst werden. </li><li> Richten Sie die Software für Dual-Anregung mit der 495 und 380 nm-Filter. Calcium-Bindung an ratiometrische PERICAM erhöht die Absorption bei 495 nm, also das Verhältnis sollte eingerichtet werden, bis 495 nm nm/380 werden. Ratiometric PERICAM hat einen Calcium-freier Anregung peak bei 415 nm 4. In diesem Protokoll, empfehlen wir mit einem 380 nm-Filter nur, weil es überall in den meisten Calcium-Imaging Laboratories ist. Wenn ein 410 nm-Filter zur Verfügung steht, ist es vorzuziehen, die 380 nm-Filter. </li><li> Erwerben Sie Bilder der Reihe nach durch alternativ spannend bei 495 und 380 nm. Erwerben Sie Bilder von Baseline-Calcium-Spiegel für mindestens 30 s vor dem Auftragen von Agonisten über eine Perfusionsapparatur. Mark Zugabe für jeden Agonisten. Belichtungszeiten und Erwerb Abständen optimiert werden um zu verhindern Ausbleichen und trotzdem mit dem nötigen zeitlichen resolution.For Beispiel für semi-schnellen Calcium-Dynamik in Reaktion auf Agonisten Stimulation beobachtet werden, wurden die Bilder alle zwei Sekunden in den Abbildungen 1 B und C. Viel schneller Abtastraten erworben sind auch möglich 6. Langfristige Bildgebung nach Staurosporin Verwaltung wurde mit einem längeren Intervall (30s) zwischen Akquisitionen (Abb. 1 D und E) erworben. </li></ol> 3. Bildverarbeitung und-analyse <ol><li> Nachdem das Experiment abgeschlossen ist, können erhaltenen Bilder offline analysiert werden. Definieren regions of interest (ROI), in dem Sie die Änderungen in Kalziumspiegel überwachen. Verwenden Sie einen ROI in einem leeren Bereich des Feldes ausgewählt Hintergrund subtrahieren, wenn nötig. Es wird darauf hingewiesen, dass die Mitochondrien sehr beweglich und dynamisch sind, und die Extrapolation Ereignisse in einem einzigen Mitochondrium über längere Zeiträume ist nicht immer möglich. So ist angesichts der hohen Beweglichkeit dieser Organellen in einigen Zelltypen, sollte die Auswahl der ROI sorgfältig überwacht werden. Darüber, wie in Abbildung 1, Mitochondrien Reaktion heterogen auf verschiedene Reize zeigt. Es ist daher wichtig zu analysieren, Daten offline und überwachen RO1 Platzierung auf einer Frame-by-Frame-Basis. Eine detaillierte Beschreibung der Mess-mitochondriale Kalzium in sehr beweglichen Mitochondrien wurde an anderer Stelle 7 beschrieben. </li><li> Erhaltene Verhältnis Messungen aus dem ROI lässt sich in Excel oder ähnlichen graphingsoftware importiert werden. Die Daten können als eine Spur vertreten Änderungen in der mitochondrialen Kalzium in einer einzigen Zelle oder einzelne Mitochondrien präsentiert werden, oder gemittelt fluorescence Signale von mehreren ROI. Wir haben auch diese Technik verwendet, um durchschnittlich mitochondriale Kalzium in einer Population von Lymphozyten Apoptose von Fas-Ligand 8 induzierte messen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2579/2579fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. (A) subzelluläre Lokalisation von ratiometrische-PERICAM-mt. Das erste Bild zeigt Live-HeLa Zelle, die ratiometrische-PERICAM-mt. Das zweite Bild zeigt Fluoreszenzfärbung mit Mitochondrien-selektiven Farbstoff MitoTracker Red CMXRos. Die gelbe Fluoreszenz in das zusammengefügte Bild zeigt Co-Lokalisation von ratiometrische-PERICAM-mt und MitoTracker Fluoreszenz. (B) Eine Reihe von Falschfarben-Verhältnis (495:380 nm) Bilder von 4 HeLa-Zellen, die mt-ratiometrische PERICAM mit 10 mM ATP behandelt . (C) Quantifizierung der Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium in die Region of Interest (ROI) in (B) mit 10 mM ATP. (D)-Serie von Falschfarben-Verhältnis (495:380 nm) Bilder einer HeLa Zelle, mt -ratiometrische PERICAM mit 0,5 uM Staurosporin behandelt. Heterogenität in der Calcium-Reaktion in einzelnen Mitochondrien ist evident, sowie erhebliche Fragmentierung der Mitochondrien durch 60 Minuten. Einige Mitochondrien oszillatorische steigt an Kalzium (weißer Pfeil Kopf), während andere dies nicht tun signifikanten Veränderungen in Calcium-Spiegel (gelber Pfeil Kopf). (E) Quantifizierung der Anstieg der globalen mitochondriale Kalzium in einem HeLa Zellen nach Induktion von Apoptose mit 0,5 uM Staurosporin.

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	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li><li>Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+signalling+and+cell+death:+approaches+for+assessing+the+role+of+mitochondrial+Ca2++uptake+in+apoptosis.">Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis.</a> Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).</li><li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2++revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin.">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Shimozono, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+subcellular+Ca2++concentrations+using+a+dual-excitation+ratiometric+indicator+based+on+green+fluorescent+protein.">Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein.</a> Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).</li><li>Wozniak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+biphasic+calcium+release+from+the+endoplasmic+reticulum+for+Fas-mediated+apoptosis.">Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis.</a> J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).</li><li>Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+binds+to+inositol+(1,4,5)+trisphosphate+receptors,+amplifying+calcium-dependent+apoptosis.">Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).</li><li>Csordas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface.">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li><li>Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+intramitochondrial+and+cytosolic+pH:+early+events+that+modulate+caspase+activation+during+apoptosis.">Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li></ol>

Hier präsentieren wir Ihnen eine sehr einfache Methode zur Messung der mitochondrialen Kalzium mittels mitochondrialer gezielte ratiometrische PERICAM. Wie in Abbildung 1A dargestellt, mit Standard-Weitfeld-Optik ohne Dekonvolution ist es möglich, problemlos anzeigen einzelnen Mitochondrien in HeLa-Zellen mit akzeptablen Signal-Rausch-Verhältnis. Dies liegt daran, HeLa-Zellen, wie die meisten Zellen in Kultur, verflachen sich deutlich, wenn Anhänger wodurch der Bedarf für die konfokale Mikroskopie oder andere Spezialausrüstung. Wir haben ähnliche Ergebnisse in Jurkat-Zellen eingehalten Poly-Lysin beschichteten Deckgläsern 8 gefunden. Im Gegensatz zu Methoden unter Verwendung von Farbstoffen, ist es auch möglich, nicht-invasiv zu überwachen mitochondriale Kalzium für Stunden mit genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren wie ratiometrische PERICAM (Abb. 1E). Dies ist besonders wichtig bei der Analyse von mitochondrialen Kalzium während Zelltod. Darüber hinaus ist es auch möglich, Kernspaltung / Fragmentierung der Mitochondrien in den apoptotischen Prozess zu visualisieren. Wie in Abbildung 1D-und E dargestellt, Ursachen Staurosporin-Behandlung eine langsame Zunahme an Kalzium in ausgewählten Subpopulationen von Mitochondrien, die Peaks bei 20 Minuten. Kalziumspiegel wieder hinunter mit mitochondrialen Fragmentierung gleichzeitige, bevor sie wieder 2 Stunden nach der Behandlung. Dies steht im Einklang mit den langsamen Wellen im cytosolischen Calciumkonzentration durch Staurosporin Behandlung gemessen mit Fura-2 9 induziert. So können wichtige kinetische Informationen erhalten, die nicht mit Methoden unter Verwendung von statischen Messungen möglich werden. Obwohl wir Verhältnisse und nicht Calciumkonzentrationen in Abbildung 1 dargestellt haben, ist es möglich, den Sensor in situ zu kalibrieren, um absolute Kalziumspiegel 4, 10 zu berechnen. Eine wichtige Einschränkung zu beachten ist, dass ratiometrische PERICAM empfindlich auf pH 4, 10 ist. Da beide zytosolischen und mitochondrialen pH-Werte dramatisch verändern können während der Apoptose 11, ist dies ein wichtiger Gesichtspunkt. Titration von pH-Wert im isolierten Mitochondrien Ausdruck PERICAM zeigen, dass steigende [H +] erhöht Emission von PERICAM, wenn bei 495 nm angeregt, mit wenig Wirkung auf die Emission durch Anregung bei 410 nm, eine Eigenschaft, die ausgenutzt worden ist, um gleichzeitig die beiden mitochondrialen Kalzium stimuliert und pH 12. So selektiv Monitoring-Emission mit 410 nm Anregung bietet die Möglichkeit, nicht-ratiometrisch Monitor mitochondriale Kalzium mit reduzierter Sorge für pH-Wert. Schließlich das Protokoll hier vorgestellten erfordert nur Zugang zu einem Standard-Epifluoreszenz-Mikroskop mit weithin verfügbaren Filter, wodurch diese Technik zugänglich meisten Labors.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>MEA53310</td>
<td>Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol.</td>
</tr>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices, Inc</td>
<td>Metafluor</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Attofluor cell chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>A-7816</td>
<td>Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice.</td>
</tr>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>11668-019</td>
<td>Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies </td>
</tr>
<tr>
<td>MitoTracker Red CMXRos</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>M7512</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

monitoring dynamic changes in mitochondrial calcium levels during apoptosis using a genetically encoded calcium sensor

Dynamische Veränderungen der intrazellulären Calcium-Konzentration als Reaktion auf verschiedene Reize reguliert viele zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose 1. Während der Apoptose, Kalzium Akkumulation in den Mitochondrien fördert die Freisetzung von pro-apoptotischen Faktoren aus den Mitochondrien ins Cytosol 2. Es ist daher von Interesse direkt zu messen mitochondriale Kalzium in lebenden Zellen in situ während der Apoptose. Hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung von Zellen mit Dual-Anregung ratiometrische und nicht ratiometrisch synthetische Calcium-Indikator-Farbstoffen beladen ist nachgewiesen worden, ein zuverlässiges und vielseitiges Werkzeug, um verschiedene Aspekte des intrazellulären Calcium-Signalgebung zu studieren. Mess-cytosolische Calcium Flüsse mit diesen Techniken ist relativ einfach. Die Messung intramitochondrialem Kalziumspiegel in intakten Zellen mit synthetischen Calcium-Indikatoren wie rhod-2 und rhod-FF ist eine größere Herausforderung. Synthetische Indikatoren gezielt an die Mitochondrien haben Antworten auf wiederkehrende Anstieg der mitochondrialen Kalzium-abgestumpft, und stören Mitochondrienmorphologie 3. Zudem neigen synthetische Indikatoren ein Austreten aus den Mitochondrien über mehrere Stunden, die sie ungeeignet für langfristige Experimente macht. So haben genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren auf grün fluoreszierende Protein (GFP) 4 oder 5 Aequorin gezielt an die Mitochondrien basiert stark Messung des mitochondrialen Kalzium Dynamik erleichtert. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Echtzeit-Messung der mitochondrialen Kalzium-Flüsse in Reaktion auf verschiedene Reize. Die Methode basiert auf der Fluoreszenzmikroskopie von &quot;ratiometrische-PERICAM&quot;, die selektiv an die Mitochondrien ist gezielt auf. Ratiometric PERICAM ist ein Kalzium-Indikator auf eine Verschmelzung von zirkular permutiert gelb fluoreszierendes Protein Calmodulin und 4 basiert. Die Bindung von Kalzium zu ratiometrische PERICAM bewirkt eine Verschiebung der Anregungs-Spitzenwert von 415 nm bis 494 nm, während das Emissionsspektrum, die Gipfel rund um 515 nm, bleibt unverändert. Ratiometric PERICAM bindet ein einzelnes Kalzium-Ionen mit einer Dissoziationskonstante in vitro von ~ 1,7 uM 4. Diese Eigenschaften der ratiometrische PERICAM erlauben die Quantifizierung der schnelle und langfristige Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium-Konzentration. Darüber hinaus beschreiben wir die Anpassung dieser Methode auf einem Standard-wide-field Kalzium-Imaging-Mikroskop mit gängigen Filter-Sets. Mit zwei verschiedenen Agonisten, die purinergen Agonisten ATP und Apoptose-induzierenden Medikamenten Staurosporin zeigen wir, dass diese Methode geeignet zur Überwachung von Änderungen in der mitochondrialen Kalzium-Konzentration mit einer zeitlichen Auflösung von Sekunden bis Stunden. Darüber hinaus haben wir auch zeigen, dass ratiometrische PERICAM ist auch nützlich für die Messung mitochondrialen Spaltung / Fragmentierung während der Apoptose. So ist ratiometrisch PERICAM besonders gut für die langfristige, kontinuierliche Messung des mitochondrialen Kalzium-Dynamik während der Apoptose geeignet.

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Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-Messung der mitochondrialen Kalzium-Flüsse durch Fluoreszenz-Imaging. Das Verfahren nutzt ein zirkular permutiert YFP-basierte Dual-Anregung ratiometrische Calcium-Sensor (ratiometrisch PERICAM-mt) selektiv in den Mitochondrien zum Ausdruck gebracht.

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

monitoring-dynamic-changes-mitochondrial-calcium-levels-during

Research

JoVE Journal

Biology

23.8K Aufrufe.  University of Texas Medical Branch. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-Messung der mitochondrialen Kalzium-Flüsse durch Fluoreszenz-Imaging. Das Verfahren nutzt ein zirkular permutiert YFP-basierte Dual-Anregung ratiometrische Calcium-Sensor (ratiometrisch PERICAM-mt) selektiv in den Mitochondrien zum Ausdruck gebracht.

Serie: Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Single Molecule Methoden zur Überwachung von Veränderungen in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Forschung

Biologie

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths.  The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding.  Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.

Calcium signals play a key role in many cellular processes including gene expression, survival and differentiation. Here we demonstrate how to perform calcium imaging using Fura-2 AM. Calcium imaging is a valuable tool to study the regulation of intracellular calcium in real time and its regulation of signaling cascades.

Calcium Imaging von kortikalen Neuronen mit Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) channels. CRAC channels play important role in regulation of T cell proliferation and gene expression. Abnormal CRAC channel function in T cells has been linked to severe combined immunodeficiency and autoimmune diseases 1, 2 . Studying CRAC channel function in human T cells may uncover new molecular mechanisms regulating normal immune responses and unravel the causes of related human diseases. Electrophysiological recordings of membrane currents provide the most accurate assessment of functional channel properties and their regulation. Electrophysiological assessment of CRAC channel currents in Jurkat T cells, a human leukemia T cell line, was first performed more than 20 years ago 3, however, CRAC current measurements in normal human T cells remains a challenging task. The difficulties in recording CRAC channel currents in normal T cells are compounded by the fact that blood-derived T lymphocytes are much smaller in size than Jurkat T cells and, therefore, the endogenous whole-cell CRAC currents are very low in amplitude. Here, we give a step-by-step procedure that we routinely use to record the Ca2+ or Na+ currents via CRAC channels in resting human T cells isolated from the peripheral blood of healthy volunteers. The method described here was adopted from the procedures used for recording the CRAC currents in Jurkat T cells and activated human T cells 4-8.

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

We provide a step-by-step protocol for whole-cell patch clamp recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) currents in peripheral blood mononuclear cell-derived human T lymphocytes.

Whole-Cell Aufnahme von Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Ströme in menschlichen T-Lymphozyten

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Mess-Fast-Flux Calcium in Kardiomyozyten

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

Monitoring ER / SR Calcium Release mit dem gezielten Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor Catcher<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

In Echtzeit In Vivo Aufnahme von Arabidopsis Kalziumsignale während der Fütterung mit einer fluoreszierenden Biosensor Insekt

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis of the screen is to generate a mutant population that can be screened with a phenotype of interest. EMS (ethyl methane sulfonate) is a commonly used alkylating agent for inducing random mutation in a classical forward genetic screen to identify multiple genes involved in any given process. Cytosolic calcium (Ca2+) elevation is a key early signaling pathway that is activated upon stress perception. However the identity of receptors, channels, pumps and transporters of Ca2+ is still elusive in many study systems. Aequorin is a cellular calcium reporter protein isolated from Aequorea victoria and stably expressed in Arabidopsis. Exploiting this, we designed a forward genetic screen in which we EMS-mutagenized the aequorin transgenic. The seeds from the mutant plants were collected (M1) and screening for the phenotype of interest was carried out in the segregating (M2) population. Using a 96-well high-throughput Ca2+ measurement protocol, several novel mutants can be identified that have a varying calcium response and are measured in real time. The mutants with the phenotype of interest are rescued and propagated till a homozygous mutant plant population is obtained. This protocol provides a method for forward genetic screens in Ca2+ reporter background and identify novel Ca2+ regulated targets.

A forward genetic screen based on Ca2+ elevation as a read-out leads to identification of genetic components involved in calcium dependent signaling pathways in plants.

Forward Genetic Screen Mit transgenem CalciumReporter Aequorin, um neuartige Ziele bei der Calciumsignalisierung zu identifizieren

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...