Diese Forschung wird von der MRC und der BBSRC Zuschüsse. Wir bedanken uns bei Agata Zieba und Katerina Pardalis in Ulf Landegren Lab, Universität Uppsala für die Hilfe bei der Einrichtung der Technik und nützliche Ratschläge. Olink Biosience für technische Hilfe und die Präsentation.

1. Beschichtung von Zellen und die Behandlung mit BMP <ol><li> Kultur Neuro2a Zellen in GMEM mit 10% FBS, 1x Non-essentiellen Aminosäuren (NEAM), 1x Natriumpyruvat und 1x L-Glutamin. Split die Zellen mit Trypsin (0,05%-EDTA) und Platte 15,000-20,000 Zellen pro Well in einer 16-Well-Kammer schieben. Kultur HEK293T oder Cos7 Zellen in DMEM mit 10% FBS, 1x L-Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin ergänzt. Sterilisieren Polysine gleitet durch Eintauchen in 70% Ethanol und mit Immedge Stift gezeichnet 1 cm 2 Brunnen. Split die Zellen mit Trypsin (0,05%-EDTA) und Platte 20,000-25,000 Zellen pro Well in 50 ul Medium. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten, 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Nach 24 h ersetzen das Medium mit serumfreiem GMEM (ergänzt mit 0,1% Albumin, 1x NEAM, 1x Natriumpyruvat und 1x L-Glutamin) für Neuro2a oder mit serumfreiem DMEM (ergänzt mit L-Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin) für HEK293T / Cos7 und inkubieren Sie die Zellen für 2-3 h. Halten Sie drei Brunnen mit Zellen unter normalen Kulturbedingungen (dh 10% FBS) als Kontrollen. </li><li> Behandeln Sie die Zellen mit dorsomorphin (Inhibitor des BMP-Weg, 2 pM) oder BMP4 (25 ng / ml) für die gewünschte Zeit (zB für 10 min-1 h) 5. </li></ol> 2. Fixierung und Permeabilisierung <ol><li> Bereiten Sie das Fixiermittel, 4% PFA. 4 g PFA eine 4% ige Lösung in 100 ml PBS vorzubereiten. Wärmen Sie die Lösung bei 50 ° C, bis klar ist. Filter die Lösung durch einen 0,22 um Filter und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung. Verwenden Sie frische Fixierlösung (nicht länger als 2 Tage gelagert). </li><li> Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen und waschen mit 1xPBS. Pipettieren Sie nicht die Lösungen direkt auf die Zellen, da dies in Ablösung der Zellen führen kann. Bevor wir zum nächsten Schritt, wenn Chamber Slides verwendet werden entfernen Sie den Kammern, aber lassen Sie das Silizium um den Brunnen. </li><li> Dann werden 50 ul 4% PFA und Inkubation für 10min bei RT ohne Schütteln. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit PBS für 3 x 5 min in einem Coplin jar unter Rühren bei RT. </li><li> Behandeln Sie die Zellen mit 0,5% Triton X-100 in PBS für 10 min ohne Schütteln bei RT. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 0,05% Tween 20 in TBS (TBS-T) für 3 x 5 min in einem Coplin jar unter Rühren bei RT. </li></ol> 3. Sperrung <ol><li> Tippen Sie die TBS-T. Einen Tropfen DuoLink II Blocking Solution (1x) pro Vertiefung. </li><li> Inkubieren Sie die Folien in einer vorgewärmten feuchten Kammer 1 h bei 37 ° C. </li></ol> 4. Primärantikörper <ol><li> Mix und verdünnen aP-Smad1/5/8 (Kaninchen polyklonal) bei 1:100 und ein-Smad4 (monoklonaler Maus) bei 1:100 in der DuoLink II Antibody Diluent (1x). Bereiten Sie auch aP-Smad1/5/8 und a-Smad4 allein bei den gleichen Konzentrationen für Kontrollen verwendet werden. </li><li> Tippen Sie die Blocking Solution von den Folien. Entfernen Sie so viel Blockierungslösung wie möglich, aber seien Sie besonders vorsichtig, dass sich keine Zellen trocknen, bevor Sie den Antikörper. Zugabe von 40 ul des Antikörper-Lösungen in die Vertiefungen. In einem gut fügen Sie nur Antibody Diluent als zusätzliche negative Kontrolle. </li></ol> 5. PLA-Sonden <ol><li> Verdünnen Sie die beiden PLA-Sonden (DuoLink II anti-Maus-MINUS und DuoLink II anti-Rabbit PLUS) 1:5 in Antibody Diluent. </li><li> Tippen Sie den primären Antikörper-Lösung aus den Folien. Waschen Sie die Slides 2 x 5 min mit jeweils 1x DuoLink II Waschpuffer A in einer Coplin jar unter Rühren bei RT. </li><li> Tippen Sie den Waschpuffer A aus den Folien und fügen Sie den PLA-Sonde-Lösung (40 ul / well). Inkubieren Sie die Folien in einer vorgewärmten feuchten Kammer 1 h bei 37 ° C. </li></ol> 6. Ligation <ol><li> Vortex die DuoLink II Ligation Lager (5x) und verdünnen 1:5 in hochreinem Wasser und mischen. Bei der Berechnung des Volumens des Wassers berücksichtigt das Volumen der Ligase, dass bei einer endgültigen Verdünnung von 1:40 kurz vor der Zugabe der Mischung in die Vertiefungen hinzugefügt werden. </li><li> Tippen Sie den PLA-Sonde Lösung aus dem Schlitten. Waschen Sie die Slides in 1x Wash Buffer A für 2 mal 5 min jeweils in einer Coplin jar unter Rühren bei RT. </li><li> Nehmen Sie die Ligase aus der Tiefkühltruhe mit einem Einfrieren Block (-20 ° C). Fügen Sie die Ligase die Ligation-Lösung (hergestellt in 6,1) bei einer 1:40-Verdünnung und vortexen. </li><li> Tippen Sie den Waschpuffer A aus den Folien und fügen Sie die Ligation-Ligase-Lösung in jede Vertiefung (40 ul / well). Inkubieren Sie die Folien in einer vorgewärmten feuchten Kammer für 30 min bei 37 ° C. </li></ol> 7. Verstärkung Hinweis: Light sensitive Reagenzien. Halten Sie die Folien vor Licht geschützt. <ol><li> Verdünnen Sie die DuoLink II Amplification Lager (5x) 1:5 in hochreinem Wasser und mischen. Bei der Berechnung des Volumens des Wassers berücksichtigt das Volumen der Polymerase, dass bei einer endgültigen Verdünnung von 1:80 kurz vor der Zugabe der Mischung zu th hinzugefügt werdene Brunnen. </li><li> Tippen Sie die Ligation-Ligase-Lösung von den Folien. Waschen Sie die Slides in 1x Wash Buffer A mit 2 mal 2 min jeweils in einer Coplin jar unter Rühren bei RT. </li><li> Nehmen Sie die Polymerase aus dem Gefrierschrank mit einem Einfrieren Block (-20 ° C). Fügen Sie die Polymerase die Amplification-Lösung (hergestellt in 7,1) bei einer 1:80 Verdünnung und Wirbel. </li><li> Tippen Sie den Waschpuffer A aus den Folien und fügen Sie die Amplification-Polymerase-Lösung in jede Vertiefung (40 ul / well). Inkubieren Sie die Folien in einer vorgewärmten feuchten Kammer für 100 min bei 37 ° C. </li></ol> 8. Vorbereitung für Imaging Hinweis: Light sensitive Reagenzien. Halten Sie die Folien vor Licht geschützt. <ol><li> Tippen Sie die Amplification-Polymerase-Lösung aus der Dias und Wäsche für 2 mal 10 Minuten jeweils in 1x DuoLink II Waschpuffer B in einem Coplin jar unter Rühren bei RT. </li><li> Tauchen Sie die Objektträger in 0,1 x Waschpuffer B. </li><li> Entfernen Sie das Silikon aus den 16-Well-Objektträger vollständig. Add ~ 40 ul der DuoLink II Eindeckmedium mit DAPI auf dem Deckglas und legen Sie sie vorsichtig über die Proben drücken es leicht an, so dass es keine Luftblasen unter dem Deckglas. Fix und Deckglasränder auf dem Objektträger mit Nagellack. Warten Sie mindestens 15 Minuten, bevor Sie mit Bildgebung. </li><li> Analysieren Sie die Proben mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop oder. Erhalten digitalen Bildern. </li></ol> 9. Quantifizierung Hinweis: Light sensitive Reagenzien. Halten Sie die Folien vor Licht geschützt. <ol><li> Verwenden Sie DuoLink ImageTool, um die Signale auf die Bilder verlassen, dass eine Messung der Signal-Niveau zu erhalten. </li><li> Vergleichen Sie die Messungen und eine Grafik. </li></ol> 10. Repräsentative Ergebnisse Die Ergebnisse einer In-situ PLA Experiment zeigt, wie diskrete fluoreszierenden Flecken. Die Lage des Signals hängt von der spezifischen Proteine ​​untersucht. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" /> Abbildung 1. In situ PLA auf Neuro2a Zellen nach BMP4 Stimulation. Die Zellen wurden mit 2 uM dorsomorphin (Inhibitor des BMP-Weg) (A) bzw. 25 ng / ml BMP4 behandelt (B) für 60 min oder unbehandelt (CE). Antikörper gegen P-Smad1/5/8 und Smad4 wurden verwendet, um die aktive Komplexe in A und B. Die primären Antikörper aP-Smad1/5/8 allein (C) und a-Smad4 allein (D) oder Unterlassung des primären erkennen Antikörper (E) wurden als Kontrollen verwendet. Blau: DAPI; Rot: PLA-Signal. Bilder wurden mit einem Leica SP5 konfokalen Mikroskop erreicht. (F) Der PLA-Signale wurden mit dem DuoLink ImageTool Software gezählt und die durchschnittliche Zahl der Stellen in den Zellkern pro Zelle ist in der Grafik dargestellt. (G) Neuro2a Zellen blieben unbehandelt oder behandelt mit Dorsomorphin (2 uM) oder BMP4 (25 ng / ml) für 60 min. Die Zellen wurden lysiert und die Proteine ​​wurden auf SDS-PAGE unterzogen und analysiert durch Immunoblotting mit aP-Smad1/5/8 und a-PCNA als Ladekontrolle. (*) Nicht-spezifische Bande. Beachten Sie, dass die aP-Smad1/5/8 Antikörper kann nicht zwischen den 3 verschiedenen Proteinen zu unterscheiden, die in Komplex mit Smad4.

<ol>
	<li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. o. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction.">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li><li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses.">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism.">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li><li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun/AP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun/Fra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo.">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 .</li><li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia.">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li><li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor/retinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids.">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li></ol>

Die Produktion dieses Video-Artikel wurde von OLink gesponsert wer macht ein Reagenz in der Nähe Ligation Assay-Verfahren verwendet.

Die Visualisierung von Protein-Komplexe in situ ist in der großen Nachfrage, insbesondere für Studien in die signalisieren, wo Protein-Interaktion und Modifikation von Proteinen der bedeutet, dass Zellen für das Senden eines Signals von der Oberfläche zum Kern sind. Es war nicht möglich, zu visualisieren und zu quantifizieren Komplexen zwischen zwei endogene Proteine ​​in situ mit Immunfluoreszenz vor. Co-Lokalisation von Antikörper weist eine geringe Auflösung und kann nicht verwendet werden, um echte Interaktion zu visualisieren. PLA ist eine neue Technik, die Forscher haben begonnen, mit in verschiedenen Systemen mit großem Erfolg 6, 7. Hier zeigen wir, wie PLA Nutzung nicht nur zu visualisieren, sondern auch zu quantifizieren endogenen Komplexen zwischen Smad Effektoren stromabwärts von BMP Stimulation im Laufe der Zeit aktiviert. Wir verwendeten verschiedene Gewebekulturzellen einschließlich Neuro2a und verließ sich auf kommerzielle Antikörper in verschiedenen Spezies (Maus a-Smad4 und Kaninchen aP-Smad1/5/8) angehoben, um diese (Abb. 1) zu erreichen. Diese Methode erlaubt uns, zum ersten Mal, um die Aktivierung von BMP-Effektor-Komplexe im Laufe der Zeit zu sehen und nicht nur die Anwesenheit des phosphorylierten Smad1/5/8, die nicht alle können in aktive Komplexe mit Smad4 engagieren. Wir zählten die Signale (Abb. 1F) und im Vergleich der Messung mit der Quantifizierung von Immunoblot der gleichen Zellen 8 (Abb. 1G) erhalten. Wir schlossen daraus, dass die Zahl der Stellen eine genaue vergleichende Messung der Signal-Niveau im Laufe der Zeit geben. Die Technik wurde auch bei anderen Zelllinien (HEK293T und Cos7) mit ähnlichen Ergebnissen (Daten nicht gezeigt) aufgebracht. Das Prinzip der Technologie basiert auf zwei einzigartige Sonden mit den DuoLink Kit bereitgestellt werden. Jeder PLA Sonde besteht aus einem sekundären Antikörper an einer einzigartigen synthetischen Oligonukleotid, welches als Reporter fungiert. Die Nähe der Sonden ermöglicht DNA Ligation an den genauen Ort, wo diese Sonden in der Nähe angebracht werden. Der Abstand der Oligonukleotide, die DNA-Hybridisierung und Ligation ist klein (&lt;40nm) und ermöglicht somit, kann nur Proteine, die interagieren können Ligation. Die ligierten DNA kann dann verstärkt und detektiert werden mit Hybridisierung von markierten Oligonukleotiden der amplifizierten Sequenz. Die Verstärkung ist spezifisch, wie es auf DNA-DNA-Hybridisierung Prinzipien abhängt und auch eine hohe Empfindlichkeit der ligierten DNA Mehrfaches was zu Verbesserung des ursprünglichen Ligationsereignis verstärkt wird. Die amplifizierte DNA wird durch Hybridisierung mit markierten Oligonukleotiden erkannt und erzeugt einen sichtbaren und ziemlich großen Fleck. Da die Spots gezählt werden kann, bietet der PLA-Signal nicht nur die exakte räumliche Informationen (Ort der Interaktion Ereignisse), sondern auch eine objektive Möglichkeit zur Quantifizierung dieser Ereignisse 2-4. Andere Techniken, die für die Detektion von Protein-Interaktionen eingesetzt werden, sind Co-Immunopräzipitation, Immunfluoreszenz und Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET). Co-Immunpräzipitationsassays sind weit verbreitet ermöglicht die Isolierung von Protein-Komplexen. Das Verfahren ist durch Immunoblot was bedeutet, dass die Proteine ​​auf relativ hohem Niveau ausgedrückt werden muss, um erkannt zu werden begleitet. Probleme der hohen Hintergrund oder unspezifische Bindung von einigen Proteinen, die Perlen sind manchmal schwer zu in Co-Immunopräzipitation zu überwinden. Darüber hinaus ermöglichen Co-Immunopräzipitation Assays zum Nachweis von Proteinen, die Teil eines Protein-Komplex werden können, aber nicht unterscheiden kann, diejenigen, die in unmittelbarer Nähe physikalisches Zusammenwirken mit einander sind. Darüber hinaus können Co-Immunpräzipitationen keine Quantifizierung in einzelne Zelle Auflösung oder Informationen über die Lokalisation der Protein-Komplexe in der Zelle. Nachweis der Koexistenz von Proteinkomplexen in einer Zelle oder einem Zell-Kompartiment durch Immunfluoreszenz auf die Überlappung von diffusen Signalen beruht und daher eine geringe räumliche Auflösung und kann keine genauen Informationen über Protein-Interaktionen. Die Quantifizierung der Immunfluoreszenz-Signal kann durch visuelle Abschätzung erfolgen nur, wenn der Unterschied ist ein Mehrfaches, und kann nicht richtig oder messbar wie die PLA-Spots. FRET ermöglicht die Visualisierung von Proteinkomplexen in lebenden Zellen und überwindet die Notwendigkeit für Antikörper und die Exposition des Epitops. Allerdings FRET in der Regel abhängig von der Überexpression von künstlichen Fusionsproteine, die nicht widerspiegeln kann das endogene Protein-Komplexen, wie in der PLA. Blocking Bedingungen in der PLA-Protokoll sind wichtig, denn Antikörper Aggregation auftreten und erhöhen den Hintergrund. Alternative blockiert Bedingungen können in Antikörper-Produkt zu entnehmen. Entsprechende Kontrollen mit primären und sekundären Antikörper Unterlassung liefern Informationen darüber, was kann falsch gelaufen sein und sie müssen immer aufgenommen werden. Es ist wichtig, verschiedene Antikörper, die am wenigsten Hintergrund, wenn sie allein verwendet werden und das beste Signal geben wird, wenn sie zusammen Bildschirm. Fixation von cells ist wichtig, da über die Festsetzung kann Protein-Komplexe vollständig denaturiert und abgebaut, während unzureichende Fixierung kann zum Verlust der Protein-Komplexen während der Schritte des Verfahrens führen. Dies kann durch eine Senkung der Konzentration des Fixiermittels 3% oder durch eine Begrenzung der Fixierung gesteuert werden. Allerdings hängt die Fixierung auch davon ab, ob der primäre Antikörper erkennen denaturierte Proteine ​​oder nicht. Da die PLA Technik ist sehr empfindlich sind, ist besondere Sorgfalt erforderlich, um die Inkubationszeiten und Mikro Bedingungen gleich zwischen den verschiedenen Proben zu halten. Die Proben sollten nicht nach links auf jeden Fall vor dem letzten Schritt zu trocknen. Trocknung der Proben kann zu einer erhöhten Hintergrund führen. Die vollständige Entfernung der Blockierungslösung ist auch entscheidend, um Hintergrund zu vermeiden. Der Waschpuffer sollte immer vor dem Gebrauch Raumtemperatur gebracht werden, wie niedrige Temperatur verlangsamt sich die enzymatischen Reaktionen. Für weitere Informationen zur Fehlerbehebung, um das Handbuch des Kit beziehen. Es ist nützlich, um Flecken zu verwenden, um die subzelluläre Lokalisation der PLA-Signal (zB DAPI, Aktin etc) zu ermitteln. Hier haben wir DAPI (in der Montage-Medium) benutzt, um die Kerne zu färben. PLA ist kompatibel mit der Verwendung von Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen Zelltyp oder zellulären Kompartiment (hier nicht dargestellt) zu bestimmen. Genaue Quantifizierung kann durch Zählen der Signale und die Verwendung einer bestimmten Software (DuoLink Image Tool, Olink Biosience) durchgeführt werden. Zusammenfassend haben wir gezeigt, wie man in situ PLA zu verwenden, mit dem DuoLink Kit zum Nachweis BMP-Signalweg in fixierten Zellen und präsentierte seine Vorteile: einfach zu bedienen, sehr empfindlich, keinen Hintergrund, und eine einzigartige Fähigkeit zur aktiven BMP quantifizieren Signalisierung in situ. Die Begrenzung der Anwendung dieser Technik auf verschiedene Protein-Interaktionen zu studieren, hängt von der Verfügbarkeit und Qualität der primären Antikörper, die die Proteine ​​erkennen untersucht.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>GMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21710025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21063029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutogenBioclear</td>
<td>7.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11149068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11360070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16-well chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>178599</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-pSmad1/5/8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-Smad4 (B8) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>sc-7966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dorsomorphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>171260-10MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant Mouse BMP-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>5020-BP-010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton-X 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>H5151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Detection Reagents (Orange)</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OLINK</td>
<td>92007-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92004-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92002-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Mounting Medium with DAPI</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82040-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Wash Buffers Fluorescence</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82049</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using in situ pla, a proximity ligation assay

BMPs sind verantwortlich für eine Vielzahl von Entwicklungs-und biologische Wirkungen. BMP-Rezeptoren aktivieren (phosphorylieren) die Smad1/5/8 Effektoren, die dann einen Komplex mit Smad4 und translozieren in den Zellkern, wo sie fungieren als Transkriptionsfaktoren an BMP spezifischen nachgelagerten Effekte 1 einzuleiten. Traditionelle Immun-Fluoreszenz-Verfahren mit Antikörpern gegen Phospho-Smad Peptide weisen eine geringe Empfindlichkeit, hohe Hintergrund und bieten grobe Quantifizierung, wie sie auf die Intensität des Antikörpers Signal besonders berufen, wenn dies lichtempfindliche fluoreszierend. Darüber hinaus können phospho-Smads nicht alle im Komplex mit Smad4 und engagiert in der aktiven Transkription. In situ PLA ist eine Technologie zum Aufspüren von Protein-Interaktionen mit hoher Spezifität und Sensitivität 2-4. Diese neue Technologie Paare Antikörper-Erkennung mit der Amplifikation von DNA-Surrogat des Proteins. Es erzeugt eine lokalisierte, diskrete Signal in einer Form von Flecken enthüllt die genaue Position der Anerkennung Veranstaltung. Die Anzahl der Signale gezählt und verglichen die Bereitstellung einer Messung. Wir wandten in situ PLA, mit dem DuoLink-Kit, mit einer Kombination aus Antikörpern, die den Nachweis der BMP-Signalweg Effektoren phospho-Smad1/5/8 und Smad4 erlaubt nur, wenn diese in der Nähe, dh in einem Komplex, der tritt nur bei Signalisierung Aktivierung. Dieses zum ersten Mal, die Visualisierung und Messung der endogenen BMP-Signalweg mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit in einem zeitlichen Verlauf Experiment unter BMP4 Stimulation erlaubt.

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Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Hier zeigen wir, wie Proximity Ligation Assay (PLA), mit einer Kombination von Antikörpern zu verwenden, um Bone Morphogenetic Protein (BMP)-Signalisierung in fixierten Zellen sichtbar zu machen. Diese Technik erlaubt es uns, die nukleare Anreicherung von endogenen BMP aktivierten Effektor-Komplexe folgen und zu quantifizieren, ihre Werte im Laufe der Zeit unter BMP4 Stimulation.

Erkennung von Signaling Effektor-Komplexe Downstream von BMP4 Mit In situ PLA, einem Proximity Ligation Assay

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

detection-signaling-effector-complexes-downstream-bmp4-using-situ-pla

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

31.6K Aufrufe.  Imperial College, Hammersmith Hospital. Hier zeigen wir, wie Proximity Ligation Assay (PLA), mit einer Kombination von Antikörpern zu verwenden, um Bone Morphogenetic Protein (BMP)-Signalisierung in fixierten Zellen sichtbar zu machen. Diese Technik erlaubt es uns, die nukleare Anreicherung von endogenen BMP aktivierten Effektor-Komplexe folgen und zu quantifizieren, ihre Werte im Laufe der Zeit unter BMP4 Stimulation.

Serie: Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Forschung

Biologie

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Messung der Stoffwechselrate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Mit Respirationstest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel<em&gt; In-situ-</em&gt; Verwenden der TUNEL-Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Nachweis von miRNA Targets in Hochdurchsatz-Verwendung des 3&#39;LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

Anwendungen der räumlich-zeitliche Zuordnung und Partikel-Analyse-Techniken zu quantifizieren, intrazellulären Ca2 + Signalisierung In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.

Nachweis von Plasmodium Sporozoiten in Anopheles-Mücken mit einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female ...

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. Despite the clinical significance of scar formation and impaired wound healing, our understanding of fascia fibroblast dynamics in wound healing is cursory due to the lack of relevant assays that enable direct visualization of fibroblast choreography and dynamics in complex environments such as in skin wounds. This paper presents a protocol to generate ex- situ skin scars using SCAD or &#34;SCar-like tissue in A Dish&#34; that emulate the complex environment of skin wounds. In this assay, 2 mm full-thickness skin is excised and cultured upside down in media for 5 days, during which scars and skin contractures develop uniformly. This methodology, coupled with fibroblast-lineage specific transgenic mouse models, enables visualization of individual fibroblast lineages across the entire wound repair process. Overall, this protocol aids&#160;researchers in understanding fundamental processes and mechanisms of wound repair,&#160;directly exploring the effects of modulators on wound healing outcomes.

Visualizing Scar Development Using SCAD Assay - An Ex-situ Skin Scarring Assay

This protocol describes the generation of a skin-fascia explant termed "SCar like tissue in A Dish" or SCAD. This model allows unprecedented visualization of single fibroblasts during scar formation.

Visualisierung der Narbenentwicklung mit SCAD Assay - einem Ex-situ Hautnarbentest

The mammalian global response to sealing deep tissue wounds is through scar formation and tissue contraction, mediated by specialized fascia fibroblasts. ...

Verbesserte Isolierung bakterieller extrazellulärer Vesikel für Mikrobiota-Multi-Omics

Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation

Bacterial extracellular vesicles (BEVs) are nanovesicles derived from bacteria that play an active role in bacteria-bacteria and bacteria-host communication, transferring bioactive molecules such as proteins, lipids, and nucleic acids inherited from the parent bacteria. BEVs derived from the gut microbiota have effects within the gastrointestinal tract and can reach distant organs, resulting in significant implications for physiology and pathology. Theoretical investigations that explore the types, quantities, and roles of BEVs derived from human feces are crucial for understanding the secretion and function of BEVs from the gut microbiota. These investigations also necessitate an improvement in the current strategy for isolating and purifying BEVs.
This study optimized the isolation and purification process of BEVs by establishing two density gradient centrifugation (DGC) modes: Top-down and Bottom-up. The enriched distribution of BEVs was determined in fractions 6 to 8 (F6-F8). The effectiveness of the approach was evaluated based on particle morphology, size, concentration, and protein content. The particle and protein recovery rates were calculated, and the presence of specific markers was analyzed to compare the recovery and purity of the two DGC modes. The results indicated that the Top-down centrifugation mode had lower contamination levels and achieved a recovery rate and purity similar to that of the Bottom-up mode. A centrifugation time of 7 h was sufficient to achieve a fecal BEV concentration of 108/mg.
Apart from feces, this method could be applied to other body fluid types with proper modification according to the differences in components and viscosity. In conclusion, this detailed and reliable protocol would facilitate the standardized isolation and purification of BEVs and thus, lay a foundation for subsequent multi-omics analysis and functional experiments.

Autor im Rampenlicht: Beschleunigung der Forschung zur Trennung und Heterogenität bakterieller extrazellulärer Vesikel 

This study describes a method to isolate and purify bacterial extracellular vesicles (BEVs) enriched from human feces via density gradient centrifugation (DGC), identifies the physical characteristics of BEVs from morphology, particle size, and concentration, and discusses the potential applications of the DGC approach in clinical and scientific research.