Viral abgegebene optogenetische Konstrukte erlauben eine detaillierte elektrophysiologische Charakterisierung der Physiologie und Plastizität spezifischer Synapsen in akuten Hirnschnitten. Der Hauptvorteil der optogenetischen Aktivierung von Synapsen ist die Fähigkeit, weitreichende Signalwege zu untersuchen, und die selektive Stimulation von Axonen, die nicht anatomisch getrennt sind. Das Verfahren wird von Dr. Lisa Kinnavane, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus unserem Labor, demonstriert.
Legen Sie zunächst eine Hamilton-Spritze in eine Mikroinjektionsspritzenpumpe, die an einem beweglichen Arm befestigt ist, der an einem stereotaktischen Rahmen montiert ist. Dann legen Sie ein Fünf-Mikroliter-Aliquot des Virus in eine Mikrozentrifuge. Drehen Sie die Tube für einige Sekunden und pipetten Sie zwei Mikroliter des viralen Präparats in den Deckel der Röhre.
Um die Spritze mit dem viralen Präparat zu füllen, betrachten Sie die Nadelspitze mit einem Operationsmikroskop. Platzieren Sie dann manuell den Bolus des Virus an der Nadelspitze und ziehen Sie den Spritzenkolben mit den Pumpensteuerungen heraus. Stellen Sie das Einspritzvolumen der Pumpe auf 300 Nanoliter und die Durchflussrate auf 100 Nanoliter pro Minute ein.
Lassen Sie die Pumpe laufen und bestätigen Sie den ordnungsgemäßen Durchfluss, indem Sie den Tröpfchen des Virus an der Nadelspitze beobachten. Nehmen Sie das Virus auf einem Wattestäbchen auf und reinigen Sie die Nadel mit 70% Ethanol. Als nächstes navigieren Sie mit den Einstellschrauben am stereotaktischen Rahmen die Nadelspitze zum Bregma und notieren Sie sich die stereotaktischen Messungen, die auf den drei Vernierskalen auf dem Rahmen beobachtet werden.
Addieren oder subtrahieren Sie diese Entfernungen von Bregma-Koordinaten. Machen Sie ein Gratloch an der Schädeloberfläche mit einem Mikrobohrer, der am stereotaktischen Arm montiert ist. Führen Sie die Nadel an der vorgegebenen dorsoventralen Koordinate in das Gehirn ein und infundieren Sie ein vorgegebenes Volumen des Viruspräparats.
Lassen Sie die Nadel nach der Infusion 10 Minuten in situ, um die Diffusion des Bolus zu ermöglichen. Entfernen Sie dann die Nadel und lassen Sie die Pumpe laufen, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht blockiert ist. Zwei Wochen nach der Virusinjektion euthanasieren Sie die Ratte, sezieren Sie schnell das gesamte Gehirn und übertragen Sie es in die Saccharose-Schneidelösung.
Nehmen Sie mit einem Metallteelöffel das Gehirn auf, entsorgen Sie die überschüssige Lösung und legen Sie sie auf ein Filterpapier. Entfernen Sie mit einem Skalpell das Kleinhirn und schneiden Sie das Großhirn in der koronalen Ebene etwa zur Hälfte seiner Länge ab. Die hintere Hälfte ist der LEC-Gewebeblock.
Bringen Sie den Gewebeblock und das verbleibende Gehirn zur Saccharose-Schneidelösung zurück. Als nächstes legen Sie einen Tropfen Cyanacrylatkleber auf eine Vibratom-Bühne und verteilen Sie ihn in einer dünnen Schicht. Nehmen Sie dann mit einem Teelöffel den LEC-Gewebeblock und übertragen Sie ihn auf das Klebepflaster, so dass der vordere koronale Schnitt haften geblieben ist.
Installieren Sie die Stufe in die Vibratom-Gewebekammer und gießen Sie schnell ausreichend Saccharose-Schneidlösung, um das Gewebe einzutauchen. Nachdem Sie die ventrale Oberfläche des Gewebeblocks in Richtung Klinge ausgerichtet haben, schneiden Sie 350 Mikrometer dicke Scheiben von ventral nach dorsal mit einer langsamen Klingenvorschubgeschwindigkeit. Typischerweise können sieben Scheiben pro Hemisphäre erhalten werden.
Übertragen Sie die Scheiben in die Schichtsammelkammer. Stellen Sie die Auffangkammer dann für eine Stunde in ein 34 Grad Celsius warmes Wasserbad, bevor sie wieder Raumtemperatur erreicht. Legen Sie den Rest des Gehirns für 48 Stunden in Paraformaldehyd.
Zur Identifizierung der Zielzelle legen Sie die Scheibe in die Aufnahmekammer und immobilisieren sie mit einem Scheibenanker. Navigieren Sie bei geringer Vergrößerung mit Infrarotbeleuchtung zur LEC-Ebene fünf. Wechseln Sie dann zum Wasserimmersionsobjektiv mit hoher Vergrößerung und identifizieren Sie die pyramidalen Neuronen.
Markieren Sie die Position der Zelle auf dem Monitor mit Klebeband. Als nächstes, um eine ganze Zellpflasterklemme zu bilden, stellen Sie eine Borosilikatglas-Mikropipette her und füllen Sie sie mit intrazellulärer Aufnahmelösung. Setzen Sie die gefüllte Mikropipette in den Elektrodenhalter ein und üben Sie einen positiven Druck aus, indem Sie hart in ein Mundstück blasen, das mit dem seitlichen Anschluss des Elektrodenhalters verbunden ist.
Heben Sie das Mikroskopobjektiv so an, dass sich ein Meniskus bildet, und führen Sie die Elektrode in den Meniskus ein, bis sie auf dem Mikroskop zu sehen ist. Öffnen Sie das Fenster Dichtungstest, und stellen Sie fest, ob der Pipettenwiderstand drei bis fünf Megaohm beträgt. Berühren Sie dann die identifizierte Zelle mit einer Pipettenspitze, was zu einer Vertiefung in der Zellmembran führt.
Als nächstes üben Sie Unterdruck durch Absaugen am Mundstück aus, wodurch der Pipettenwiderstand erhöht wird. Fahren Sie fort, allmählich Unterdruck anzuwenden, bis die Zellmembran reißt, was zu Transienten der gesamten Zellkapazität führt. Um in die aktuelle Klemmkonfiguration zu gelangen, verwenden Sie eine montierte LED, die mit Filterwürfeln und entsprechender Optik in den Lichtpfad des Mikroskops gerichtet ist, und legen Sie Lichtimpulse über das 40X-Objektiv auf die Scheibe auf.
Liefern Sie Züge mit mehreren Lichtpulsen bei fünf Hertz, 10 Hertz und 20 Hertz, um die präsynaptischen Freisetzungseigenschaften zu untersuchen. Damit Biocytin das Neuron füllen kann, warten Sie mindestens 15 Minuten nach dem Eintritt in die gesamte Zellkonfiguration. Überwachen Sie in der Spannungsklemme die Membrankapazität und den Eingangswiderstand.
Ziehen Sie dann die Pipette langsam entlang des Annäherungswinkels vom Soma der Zelle weg und beobachten Sie das langsame Verschwinden von Kapazitätstransienten und Membranstrom, was auf die Wiederversiegelung der Zellmembran und die Bildung eines Außenflecks an der Pipettenspitze hinweist. Legen Sie die Scheibe in Paraformaldehyd in einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie über Nacht. Befestigen Sie mit OCT-Medium einen Gewebeblock an der Kryostatprobenscheibe.
Um das Gewebe einzufrieren, geben Sie Isopentan in einen geeigneten Behälter und tauchen Sie die Probenscheibe ein, um sicherzustellen, dass das Gewebe über dem Niveau des Isopentans liegt. Dann senken Sie den Behälter mit Isopentan in flüssigen Stickstoff und lassen Sie das Gewebe einfrieren. Sobald das Gewebe vollständig gefroren ist, lassen Sie den Gewebeblock 30 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius in der Kryostatkammer, damit sich die Temperatur des Blocks ausgleichen kann.
Schneiden Sie nach dem Gleichgewicht 40 Mikrometer dicke Abschnitte in den Kryostaten und führen Sie die Abschnitte mit einem feinen Pinsel von der Klinge. Kleben Sie diese gefrorenen Abschnitte auf einen Poly-L-Lysin-beschichteten Objektträger mit Raumtemperatur, indem Sie den Objektträger an den Abschnitten berühren. Nachdem Sie jedem Objektträger 150 Mikroliter Montagemedium hinzugefügt haben, tragen Sie den Abdeckschein auf und entfernen Sie Luftblasen durch vorsichtiges Drücken auf den Abdeckschein.
Decken Sie die Objektträger zum Schutz vor Fotobleiche ab und lassen Sie sie 12 Stunden an der Luft trocknen. Untersuchen Sie dann mit einem Fluoreszenzmikroskop die Lage der viralen Injektionsstelle. Für die Biocytinfärbung inkubieren Sie die Scheiben in 3% Wasserstoffperoxid in PBS für 30 Minuten, um jede endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren.
Dann waschen Sie die Gehirnscheiben mit PBS, bis keine weiteren Sauerstoffblasen mehr sichtbar sind. Als nächstes inkubieren Sie die Scheiben für drei Stunden in 1% Avidin-biotinylierter HRP-Komplexlösung in PBS, das 0,1% Triton X-100 enthält. Nach sechs PBS-Wäschen inkubieren Sie jede Scheibe in DAB-Lösung, bis die Biocytinfärbung neuronaler Strukturen sichtbar wird.
Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Scheiben in kaltes PBS übertragen. Anschließend die Scheiben mit einem Pinsel auf die Glasmikroskop-Objektträger montieren. Nachdem Sie überschüssiges PBS entfernt haben, fügen Sie das Montagemedium hinzu.
Decken Sie die Scheiben mit Abdeckstreifen ab und lassen Sie sie, wie zuvor demonstriert, an der Luft trocknen. Eine gesunde Pyramidenzelle wurde lokalisiert und gepatcht. Wenn eine postsynaptische Zellidentifikation erforderlich ist, sollte eine Zelle, die den fluoreszierenden Marker exprimiert, mit Hilfe einer Weitfeldoptik lokalisiert werden.
Einzelne Lichtpulse von zwei Millisekunden führten zu einfachen wellenförmigen optogenetischen exzitatorischen postsynaptischen Potentialen. Die kurzfristige Plastizität der Synapse wird durch Anwendung von fünf, 10 und 20 Hertz Lichtstimulation untersucht. Bei der Untersuchung der Langzeitplastizität verursachte die Zugabe des cholinergen Agonisten Carbachol zum zirkulierenden aCSF für 10 Minuten eine langfristige Depression, die 40 Minuten nach Entfernung des Liganden noch sichtbar war.
Die Länge der Injektionsstelle wurde histologisch untersucht. Der fluoreszierende Reporter mCherry wurde in den tieferen Schichten des prälimbischen und infralimbischen Kortex lokalisiert. Darüber hinaus bestätigte die Färbung einer mit Biozytin gefüllten Zelle ihre Lage und Morphologie.
Die kritischen Schritte dieses Protokolls sind die genaue Transduktion der afferenten Hirnregion, die post-hoc überprüft werden kann, und die schnelle Dissektion des Gehirns bei der Herstellung akuter Schnitte. Dieses Verfahren lässt sich leicht mit der fluoreszierenden Markierung eines einzelnen Zelltyps kombinieren, beispielsweise einer bestimmten Interneuronen-Unterklasse. Um dies zu tun, würden wir ein transgenes Tier verwenden, das eine Rekombinase in diesem bestimmten Zelltyp exprimiert.
Viral verabreichte optogenetische Konstrukte haben schnelle Fortschritte in den Bereichen System- und Schaltungsneurowissenschaften ermöglicht.
