Matthew O&#39;Sullivan und Fei Zhou sind Empfänger von Australian National Health and Medical Research Council Postgraduate Medical Research Stipendien.

Die sorgfältige Abwägung muss Primer und Sonde Design gegeben werden. Alle verfügbaren Sequenzen der Ziele von Interesse aus Datenbanken wie GenBank sollten genutzt werden, um konservierte Bereiche, die geeignete Ziele sind zu identifizieren. Wo eine große Anzahl von Zielen zu werden in einem einzigen Assay MPCR verstärkt, sollte jedes amplifizierte Sequenz, die ähnlich lang sein und sollte nicht mehr als 300 Basenpaare, um Wettbewerbsverzerrungen zu vermeiden. Eine alternative Anwendung der Methode ist es, eine längere Ziel mit Primern gegen konservierte Regionen zu verstärken und auf mehrere Sonden zu verwenden, um Sequenzvariation innerhalb des Amplikons zu identifizieren. In diesem Fall kann die amplifizierte PCR-Produkt länger sein. Primer Glühtemperaturen sollten alle ähnlich sein, mit PCR-Bedingungen angepasst. Primer, die starke sekundäre Struktur oder Primer-Dimer-Form sollte vermieden werden. Die Sigma Aldrich DNA-Rechner ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a> ) können verwendet werden, um zuverlässig vorhersagen diese Funktionen sein. DNA-Sonden sollten so gestaltet sein müssen Glühtemperaturen nahe 60 ° C werden Zur Maximierung der Spezifität, können zwei Sonden für jedes Ziel von Interesse in der Assay, einer Hybridisierung an den vorderen DNA-Strang neben dem Reverse-Primer-Bindungsstelle, und die andere auf der Rückseite Strang neben dem Forward-Primer-Bindungsstelle enthalten sein. In diesem Fall müssen sowohl vorwärts und Rückwärts-Primer werden Biotin-modifizierte. Wenn nur eine Sonde pro amplifizierte Target verwendet wird, dann nur ein Primer benötigt werden Biotin modifiziert. Bei der Gestaltung von Primer und Sonden für die MPCR / RLB-Assay ist es dringend empfohlen, in silico-Methoden verwenden, um PCR-Produkte und Sondenhybridisierung vorherzusagen, mit der in-vitro-Ergebnisse korrelieren. Idealerweise geschieht dies durch Isolate, für die das gesamte Genom-Sequenz ist verfügbar. Software wie FastPCR (abrufbar unter http://primerdigital.com/fastpcr.html) kann für diesen Zweck verwendet werden. Schwache oder fehlende Sondensignal vorhersagen, wo in silico-Analyse zeigt Basenpaar Mismatches was zu niedrigen Sonde Glühtemperaturen werden. DNA-Extraktion Techniken werden je nach den Proben getestet, und PCR-Bedingungen wird davon abhängen, Primer-Design. Leser werden auf Veröffentlichungen zu einzelnen Assays für weitere Informationen über DNA-Extraktion und PCR Reagenzien und Bedingungen 1-19 bezeichnet. Jeder Test wird mit geeigneten Kontrollen ausführen, um mindestens eine positive und eine negative Probe-Signal für jede Sonde auf der Membran, sowie eine DNA-freien Kontrolle. Darüber hinaus ist es vorteilhaft, eine Sonde an der Spitze der Membran, die voraussichtlich für alle Proben (zB: eine Art oder Gattung spezifische Sonde im Falle eines Mikro-Organismus) positiv ist, enthalten. Dies dient als positive Kontrolle Sonde, sondern erlaubt auch eine leichte Orientierung der Ergebnisse. 1. Vorbereitung der Membrane <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen: <ul><li> 100ml 0,5 M NaHCO3 (pH 8,4) </li><li> 100 ml 0,5 M NaHCO 3 </li><li> 20 ml 16% EDAC </li><li> 250 ml 0,1 M NaOH </li><li> 250 ml 2xSSPE </li><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - im Wasserbad bei 60 ° C </li><li> 250 ml 20 mM EDTA. </li></ul></li><li> Pre-Ofen auf 60 ° C. </li><li> Reinigen Sie die Immunetics Miniblotter mit 70% Ethanol. </li><li> Verdünnen Sie die Oligonukleotid-Sonden in 0,5 M NaHCO 3, um eine endgültige Konzentration von 2 pmol / ul und einem Volumen von 200 ul. </li><li> Schneiden Sie ein BiodyneC Nylonmembran zu 15x15 cm. Mit einem Bleistift und Lineal, Regel aus einer 0,5 cm Platz zwischen oberen Membran und schreiben Details hier. </li><li> Seal Membran in Plastikbeutel mit 20 ml frisch zubereitete 16% EDAC Lösung und Rock bei Raumtemperatur für 10 Minuten. </li><li> Wash-Membran in VE-Wasser für 30 Sekunden. </li><li> Legen Membran in miniblotter mit Kanälen laufen durch die Membran (parallel zur Bleistift-Linie). Put Stützkissen in ein und schließen Sie Löschblatt. Aspirieren Flüssigkeit aus den Kanälen. </li><li> Füllen Sie den Spuren 1 und 45 mit 150 ul 0,5 M NaHCO 3. Verwenden Sie 150 ul jeder Sonde Lösung Bahnen 2-44 in Folge zu füllen, wobei darauf geachtet, um Luftblasen zu vermeiden. Wenn eine Luftblase in den Kanal angezeigt wird, halten Sie die Pipette in Ort, rasch absaugen die Lösung, damit die Luftblase an die Spitze der Pipette float, dann wiederholen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten. </li><li> Absaugen Sonde Lösungen, entfernen Membran und waschen in 250 ml 0,1 M NaOH bei Raumtemperatur für 9 Minuten. </li><li> Wash-Membran in 250 ml 2xSSPE für 30 Sekunden. </li><li> Wash-Membran in 250 ml vorgewärmten 2xSSPE/0.1% SDS im Ofen bei 60 ° C für 5 Minuten. </li><li> Wenn nicht für die Hybridisierung verwendet werden sofort waschen Membran in 240 ml 20 mM EDTA bei Raumtemperatur für 20 Minuten (Reservierung restlichen 10ml), dann Dichtungsmembran in Plastiktüte mit den restlichen 10 ml 20 mM EDTA und Lagerunge im Kühlschrank bei 4 ° C. </li><li> Wash miniblotter mit Pyroneg Spülmittel und Bürste. Spülen und trocknen lassen. </li></ol> 2. Hybridisierung und Detektion <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen: <ul><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - Store im Wasserbad bei 60 ° C. </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - Store im Wasserbad bei 60 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - Store im Ofen bei 42 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE - halten bei Raumtemperatur </li><li> 500 ml 1% SDS - Store im Wasserbad bei 60 ° C zunächst (für Schritt 3) </li><li> 250 ml 20 mM EDTA - bei Raumtemperatur lagern (für Schritt 3). </li></ul></li><li> Biegen Sie an einem Ofen bei 60 ° C und einem Ofen auf 42 ° C. Bringen Sie Wasser in einem großen Becherglas auf einer Heizplatte kochen. </li><li> Saubere Immunetics Miniblotter mit 70% Ethanol. </li><li> Aliquot von 10 ml 2xSSPE/0.1% SDS in einen kleinen Behälter. Fügen Sie 20 ul jedes PCR-Produkt zu 150 ul 2xSSPE/0.1% SDS in nummerierten Röhrchen. </li><li> Boil PCR-Produkte für 10 min bei 100 ° C mit Styropor Inhaber. Legen Sie auf dem Eis sofort für mindestens 5 Minuten. </li><li> Wash-Membran in den restlichen 240 ml 2xSSPE/0.1% SDS in 60 ° C im Ofen für 5 Minuten. </li><li> Legen Membran in miniblotter mit Polster. Orientieren so Kanälen verlaufen vertikal (senkrecht zur Bleistift-Linie). </li><li> Saug überschüssige Flüssigkeit aus miniblotter Kanäle. </li><li> Die restlichen 150 pl 2xSSPE/0.1% SDS, um erste und letzte Kanäle. Add gekocht PCR-Produkte, um die verbleibenden Kanäle (2-44) in der Reihenfolge, wobei darauf geachtet, um Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Legen Sie miniblotter flach in 60 ° C im Ofen für 1 Stunde, damit Hybridisierung stattfinden. </li><li> Absaugen von Flüssigkeit aus jedem Kanal entfernen Membran aus miniblotter. </li><li> Zweimal waschen in vorgewärmte 250 ml 2xSSPE/0.5% SDS in 60 ° C im Ofen für 10 Minuten. </li><li> Befeuchten Nylon Trennung Mesh mit 2xSSPE/0.5% SDS bei 42 ° C und es verwenden, um Roll-up-Membran. </li><li> Legen aufgerollt Membran in Tuchwelle und entfalten, um sicherzustellen, Membran liegt an der inneren Oberfläche. Add 3 ul Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Roche Applied Science) zu 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS bei 42 ° C und Tuchwelle hinzuzufügen. Schraubverschluss fest zu und inkubieren in Rollen Ofen bei 42 ° C für 60 Minuten. Stellen Sie sicher, Richtung rollen ist so, dass Membran nicht anziehen. Überprüfen Sie regelmäßig auf Dichtheit prüfen. </li><li> Wash miniblotter in Pyroneg Reinigungsmittel und Wasser, spülen und trocknen lassen. </li><li> Entfernen Membran aus Tuchwelle. Zweimal waschen in übrigen 2xSSPE/0.5% SDS bei 42 ° C für 10 Minuten. </li><li> Zweimal waschen in 2xSSPE bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Schalten Sie Backofen bis zu 80 ° C und Ort 500ml 1% SDS in Ofen zur Vorwärmung. </li><li> Make up 15 ml Amersham ECL Detection-Lösung (7,5 ml Lösung A und 7,5 ml Lösung B). Discard 2xSSPE und fügen Detection-Lösung. Rock-sanft mit der Hand für 2 Minuten gewährleistet eine vollständige Abdeckung der Membran mit Lösung. Entsorgen chemilumineszente Lösung. </li><li> Schneiden Sie zwei Blätter aus Kunststoff Transparenz, um die Exposition Patrone passt. Legen Membran zwischen den beiden Platten aufnehmen und in Exposition Patrone. </li><li> Gehen Sie zur Dunkelkammer. Unter rotem Licht, fügen ECL Detektion Film Patrone und setzen für 5 Minuten. Dog-ear unteren rechten Ecke des Films nach der Entfernung um die richtige Ausrichtung zu ermöglichen, wenn Anzeige. </li><li> Develop-Film mit automatisierten Entwickler oder chemischen Bädern nach Anweisungen des Herstellers. </li><li> Wiederholen Sie die Belichtung mit längeren oder kürzeren Belichtungszeiten, falls erforderlich. </li></ol> 3. Regeneration der Membran <ol><li> Wash-Membran in 250 ml 1% SDS bei 80 ° C für 30 Minuten zweimal. </li><li> Wash-Membran in 240 ml 20 mM EDTA bei Raumtemperatur für 15 Minuten. </li><li> Seal Membran in Plastikbeutel mit 10 ml 20 mM EDTA und in den Kühlschrank bei 4 ° C für zukünftige Wiederverwendung. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Die Ergebnisse sind am besten, indem man die Folie über eine aufgedruckte Raster, sonst Scannen des Bildes und den Import in Software wie BioNumerics (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgien) angesehen. Jede Sonde Ergebnis sollte mit Verweis auf positive und negative Kontrolle Sonden interpretiert werden. Die Ergebnisse sind am besten als negativ, schwach positiv oder benotet. Positive Ergebnisse sind, wo das Signal so stark wie oder stärker als die positive Kontrolle Sonde. Negative Ergebnisse sind, wo das Signal fehlt oder gleich der negativen Kontrolle (im Falle der Hintergrund-Signal). Schwache Ergebnisse sind, wo das Signal schwächer als die positive Kontrolle Sonde, aber stärker als die negative Kontrolle ist. Schwache Ergebnisse können die Folge von Punktmutationen, die zu schwach Sondenbindung oder durch nicht-spezifische Signale von Primer-Dimer-Bildung werden. Die Verwendung von zwei Sonden pro Target von Interesse können zur Verbesserung der Spezifität, wo ein einzelnes schwaches Ergebnis sicher als nicht-spezifisches Signal interpretiert werden kann. Falls Zweifel bestehen, kann eine einzige komplexe PCR-Reaktion mit Gel-basierte Erkennung und Sequenzierung von jedem Verstärker durchgeführt werdenlified Produkt zu ermitteln, ob das Ergebnis ist wirklich positiv. Ein repräsentatives Ergebnis ist in Abbildung 2 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Die MPCR / RLB Prinzipien (P1) Step 1.9. Amine modifizierten Sonden sind kovalent an eine Nylonmembran gebunden. (P2) Step 2,10. Biotin modifizierten PCR-Produkte werden an die Sonden hybridisiert. (P3) Schritt 2.14. Streptavidin, mit Peroxidase markiert, ist mit der Membran inkubiert und bindet an Biotin. (P4) Steps 2,19-2,21. Peroxidase katalysiert eine Reaktion in der ECL Nachweisreagenzien, die Licht auf die lichtempfindlichen Film ausgesetzt ist. Die Membran wird dann für die Wiederverwendung gewaschen. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Representative MPCR / RLB führen. Proben 1 bis 6 stehen für positive Kontrollen - zwischen ihnen gibt es wenigstens eine positive Probe-Signal für jeden der 43 Sonden. Jeder Zielsequenz (A bis U) ist mit zwei verschiedenen Sonden, um die Spezifität zu maximieren erkannt. Sonden A1 und A2 vertreten artspezifischen Sonden, die voraussichtlich für jede Probe positiv und helfen bei der Orientierung des Films sind. Probe A1 ist an der Unterseite der Membran wiederholt. Die Proben 7 und 8 sind negative Kontrollen. Beachten Sie, dass Probes Q1, Q2, T1 und T2-Signal in den negativen Kontrollen haben, was darauf hinweist wahrscheinlich unspezifische Bindung von Primer oder Primer-Dimer-Produkt. Re-Design der Sonden oder Primer erforderlich wäre. Probes C1, D1 und F1 zeigen Streifenbildung durch die Membran wahrscheinlich auf einige nicht-spezifische Aufnahme der Streptavidin-Peroxidase-Konjugat oder Chemilumineszenzsubstrat, dies ist jedoch leicht von echten positive Probe-Signale aus. Probes D1 und D2 haben relativ schwaches Signal im Vergleich zu anderen Sonden, kann dies zu größeren Amplifikate führt zu weniger effiziente Amplifikation. Probe J2 ist negativ mehrere Proben (1, 3, 4, 6, 39), wo Sonde J1 ist positiv. Das wahrscheinlichste ist eine Mutation in der J2-Bindungsstelle für diese Beispiele.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die MPCR / RLB-Methode ermöglicht die gleichzeitige Erfassung einer großen Anzahl von PCR-Produkte. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Chemilumineszenz-Sonde-basierte Erkennung kann ein einzelner Multiplex-PCR-Reaktion mit einer großen Anzahl von Primerpaare verwendet, um die DNA-Template zu verstärken. Wenn keine Sonde Signale mit einer oder mehreren Proben, die Durchführung Gelelektrophorese mit den verbliebenen PCR-Produkt erhalten werden können unterscheiden, ob das Problem mit PCR-Amplifikation oder Sondenhybridisierung ist. Wo alle Sonde Signale auf der Membran schwach oder nicht vorhanden sind, aber Gelelektrophorese zeigt die erfolgreiche PCR-Amplifikation unter anderem die Möglichkeiten Probleme mit Kennzeichnung der Membran, fehlerhafte Regeneration der Membran nach vorheriger Verwendung, fehlerhafte Temperaturen während der Hybridisierung oder Streptavidin Inkubation oder defekte Streptavidin- Peroxidase-Konjugat oder Nachweisreagenz. Wenn Kontrollproben zeigen, dass die einzelnen Sonden können zu falsch negativen Signale, Einzel-PCR mit Gel-basierte Erkennung und anschließende Sequenzierung durchgeführt werden können, um die Amplifikation von PCR-Produkt zu überprüfen und für Sequenzvariation an der Sonde Bindungsstelle zu suchen. Schwache oder fehlende Sondensignal kann auf große Amplikon size: wenn möglich alle Amplikons sollten, die ähnlich lang und weniger als 300 bp sein. Secondary DNS-Strukturen von Amplikons können auch zu schlechten Sondenbindung und kann Re-Design der Primer erfordern. Individuelle Primer oder Sonden-Konzentrationen kann auch variiert werden, um die Signalstärke zu optimieren. Falsch positive Signale aufgrund Sonde Bindung von nonamplified Primer oder Primer-Dimer-Produkt kann durch Ausführen einzelner PCR mit Gel-basierte Erkennung und anschließende Sequenzierung untersucht werden. Wenn dies geschieht, der Sonden Redesign kann erforderlich sein können. Punktmutationen in Sonde Bindungsstellen kann schwach oder nicht vorhanden Signalen führen. Zulassen von zwei Sonden für jedes amplifizierte Produkt macht dies leicht zu erkennen. Diese Eigenschaft kann bei sorgfältiger Primer und Sonde Design zu kleinen Sequenzvariationen in Ziel-DNA zu erkennen genutzt werden. Kurzum, während es viele Methoden der Produkt-Erkennung folgenden Multiplex-PCR-Reaktionen zur Verfügung stehen, hat MPCR / RLB den Vorteil, dass High-Throughput-und kostengünstig mit geringem Setup-Kosten. Die Flexibilität der Methode erlaubt den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> 5 &#39;Amin C6 modifiziertes Oligonukleotid-Sonden </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-8875 </td><td> 0,5 M Lösung aus bis zu pH 8,4 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td> 0,1 M Lösung </td></tr><tr><td> 20xSSPE Puffer </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L-4390 </td><td> Make up 10% Stammlösung, nicht Autoklaven, sollten für 1 Woche maximal vor Gebrauch aufbewahrt werden </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td> Make up 0,5 M Lösung auf pH 8,0 eingestellt und Autoklaven </td></tr><tr><td> N-(3-Dimethylaminopropyl)-N &#39;-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDAC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7750 </td><td> Make up von 20 ml 16% ige Lösung unmittelbar vor Gebrauch mit 3,2 g EDAC und 18 ml Millipore-Wasser </td></tr><tr><td> BiodyneC 0,45 um Nylonmembran 20x20 cm </td><td> Pall Life Sciences </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Deionisiertes, gereinigtes Wasser </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Flüssige Waschmittel Pyroneg </td><td> Johnson Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-Peroxidase-Konjugat </td><td> Roche </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL Nachweisreagenzien </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL Nachweisreagenzien </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> OHP Transparency Film </td><td> Corporate Express </td><td> EXP 504 OHP </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL Hyperfilm Hochleistungs-Chemilumineszenz Film 18x24 cm </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> Eis </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Consumables in der MPCR / RLB-Assay verwendet. <table border="1"><tbody><tr><th> Ausstattung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Hybaid Shake&#39;n&#39;Stack Backöfen (2) rollen Flasche und Nylon Mesh Trennung </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> Methode kann mit einem einzigen Ofen, solange gibt es Möglichkeit für die Aufrechterhaltung der Lösungen bei 42 ° C und 60 ° C vor dem Einsatz </td></tr><tr><td> Die Bauchtänzerin Wippschüttler </td><td> Stovall Life Science </td><td> Euro BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> Mn100-45 </td><td></td></tr><tr><td> Wasserbad </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sog </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Herdplatte </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exposure Patrone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> Röntgenfilm-Entwickler </td><td></td><td></td><td> Außerdem können Entwickler, Fixierer und Wasser in Schalen in einem abgedunkelten Raum statt automatisierterEntwickler. Lumino-Imager können auch anstelle von Xray Film verwendet werden </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Ausrüstung für die MPCR / RLB-Test erforderlich.

multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)

Multiplex PCR / Reverse Line-Blot-Hybridisierung Assay erlaubt den Nachweis von bis zu 43 molekularen Ziele in 43 Proben mit einer Multiplex-PCR-Reaktion durch Sondenhybridisierung auf eine Nylon-Membran, die wieder verwendbar ist, gefolgt. Die Sonden sind 5 &#39;Amin modifiziert, um die Fixierung der Membran zu ermöglichen. Primer sind 5 &#39;Biotin modifiziert denen der Nachweis der hybridisierten PCR-Produkte unter Verwendung von Streptavidin-Peroxidase und einem Chemilumineszenz-Substrat über lichtempfindliche Folie ermöglicht. Mit niedrigen Aufbau und die Kosten für Verbrauchsmaterialien, ist diese Technik kostengünstig (ca. US $ 2 pro Probe), einen hohen Durchsatz (mehrere Membranen können gleichzeitig verarbeitet werden) und hat eine kurze Turnaround-Zeit (ca. 10 Stunden). Die Technik kann in eine Reihe von Möglichkeiten genutzt werden. Mehrere Sonden können zur Folge Variation innerhalb einer einzigen amplifizierten Produkts erkannt werden, oder mehrere Produkte gleichzeitig verstärkt werden, mit einem (oder mehreren) Sonden für die anschließende Detektion verwendet. Eine Kombination der beiden Ansätze können auch innerhalb eines einzigen Assay verwendet werden. Die Fähigkeit, mehrere Sonden für ein einzelnes Ziel-Sequenz enthalten ist der Test sehr spezifisch. Veröffentlichte Anwendungen von MPCR / RLB umfassen die Detektion von Antibiotika-Resistenzgene 1,2, Typisierung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus 3-5 und Salmonella sp 6, molekulare Serotypisierung von Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 und Enteroviren 10,11, Identifikation von Mycobacterium sp 12, Erkennung von genitalen 13-15 und Atemwege 16 und 17 anderen Krankheitserregern und Detektion und Identifizierung von Mollicutes 18. Das bedeutet jedoch, die Vielseitigkeit der Technik der Anwendungen sind nahezu unbegrenzt und nicht auf molekulare Analyse von Mikro-Organismen beschränkt. Die fünf Schritte in MPCR / RLB sind a) Primer und Probe-Design, b) DNA-Extraktion und PCR-Amplifikation c) Herstellung der Membran, d) Hybridisierung und Detektion, und e) Regeneration der Membran.

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Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Eine preiswerte, einen hohen Durchsatz-Verfahren für die simultane Detektion von bis zu 43 molekulare Ziele beschrieben. Anwendungen der MPCR / RLB gehören mikrobielle Typisierung und Erkennung von mehreren Erregern aus klinischen Proben.

Multiplex PCR und Reverse-Line-Blot-Hybridisierung Assay (MPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

multiplex-pcr-and-reverse-line-blot-hybridization-assay-mpcrrlb

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

43.4K Aufrufe.  University of Sydney. Eine preiswerte, einen hohen Durchsatz-Verfahren für die simultane Detektion von bis zu 43 molekulare Ziele beschrieben. Anwendungen der MPCR / RLB gehören mikrobielle Typisierung und Erkennung von mehreren Erregern aus klinischen Proben.

Serie: Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

Zelluläre Toxizität von Nanogenomedicine in MCF-7 Zelllinie: MTT-Assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Forschung

Biologie

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Ein Reverse Genetic Ansatz zur funktionellen Redundanz während der Embryogenese-Test

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable concentration level. But the design of conventional PCR thermocycling hardware, predominantly based on massive metal heating blocks whose temperature is regulated by thermoelectric heaters, severely limits the achievable reaction speed1. Considerable electrical power is also required to repeatedly heat and cool the reagent mixture, limiting the ability to deploy these instruments in a portable format.
Thermal convection has emerged as a promising alternative thermocycling approach that has the potential to overcome these limitations2-9. Convective flows are an everyday occurrence in a diverse array of settings ranging from the Earth's atmosphere, oceans, and interior, to decorative and colorful lava lamps. Fluid motion is initiated in the same way in each case: a buoyancy driven instability arises when a confined volume of fluid is subjected to a spatial temperature gradient. These same phenomena offer an attractive way to perform PCR thermocycling. By applying a static temperature gradient across an appropriately designed reactor geometry, a continuous circulatory flow can be established that will repeatedly transport PCR reagents through temperature zones associated with the denaturing, annealing, and extension stages of the reaction (Figure 1). Thermocycling can therefore be actuated in a pseudo-isothermal manner by simply holding two opposing surfaces at fixed temperatures, completely eliminating the need to repeatedly heat and cool the instrument.
One of the main challenges facing design of convective thermocyclers is the need to precisely control the spatial velocity and temperature distributions within the reactor to ensure that the reagents sequentially occupy the correct temperature zones for a sufficient period of time10,11. Here we describe results of our efforts to probe the full 3-D velocity and temperature distributions in microscale convective thermocyclers12. Unexpectedly, we have discovered a subset of complex flow trajectories that are highly favorable for PCR due to a synergistic combination of (1) continuous exchange among flow paths that provides an enhanced opportunity for reagents to sample the full range of optimal temperature profiles, and (2) increased time spent within the extension temperature zone the rate limiting step of PCR. Extremely rapid DNA amplification times (under 10 min) are achievable in reactors designed to generate these flows.

We describe a novel method to perform DNA replication via the polymerase chain reaction (PCR). Thermal convection is harnessed to continuously shuttle reagents between denaturing, annealing, and extension conditions by maintaining opposing surfaces of the reactor at constant temperature. This inherently simple design promises to make rapid PCR more accessible.

Rapid PCR Thermocycling mit Microscale thermische Konvektion

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridisierung und Scannen

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus biology. In the latter respect, the recent discovery of a non-structural AAV protein, termed assembly-activating protein (AAP), has shed new light on the processes involved in assembly of the viral capsid VP proteins into a capsid. Although many AAV serotypes require AAP for assembly, we have recently reported that AAV4, 5, and 11 are exceptions to this rule. Furthermore, we demonstrated that AAPs and assembled capsids of different serotypes localize to different subcellular compartments. This unexpected heterogeneity in the biological properties and functional roles of AAPs among different AAV serotypes underscores the importance of studies on AAPs derived from diverse serotypes. This manuscript details a straightforward dot blot assay for AAV quantitation and its application to assess AAP dependency and serotype specificity in capsid assembly. To demonstrate the utility of this dot blot assay, we set out to characterize capsid assembly and AAP dependency of Snake AAV, a previously uncharacterized reptile AAV, as well as AAV5 and AAV9, which have previously been shown to be AAP-independent and AAP-dependent serotypes, respectively. The assay revealed that Snake AAV capsid assembly requires Snake AAP and cannot be promoted by AAPs from AAV5 and AAV9. The assay also showed that, unlike many of the common serotype AAPs that promote heterologous capsid assembly by cross-complementation, Snake AAP does not promote assembly of AAV9 capsids. In addition, we show that the choice of nuclease significantly affects the readout of the dot blot assay, and thus, choosing an optimal enzyme is critical for successful assessment of AAV titers.

This manuscript details a straightforward dot blot assay for quantitation of adeno-associated virus (AAV) titers and its application to study the role of assembly-activating proteins (AAPs), a novel class of non-structural viral proteins found in all AAV serotypes, in promoting the assembly of capsids derived from cognate and heterologous AAV serotypes.

Eine Quantitative Dot Blot Assay für AAV Titration und seine Verwendung für funktionale Bewertung von Adeno-assoziierten Virus Assembly-aktivierende Proteine

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Absolute Quantifizierung von MicroRNA-Plasmaspiegel bei Cynomolgus Affen, über Quantitative Real-Time Reverse Transkription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...