Diese Protokolle können verwendet werden, um hauseigene Multiplex-ddPCR-Assays für den Nachweis von SARS-CoV-2 mit einem zweifarbigen ddPCR-System zu entwickeln. Dies ist nützlich für Personen, die eigene Kits für den Nachweis von SARS-CoV-2 und anderen Krankheitserregern entwickeln möchten. Im Vergleich zum Goldstandard RT-qPCR kann die RT-ddPCR verwendet werden, um mehrere SARS-CoV-2-Gene zu quantifizieren, ohne dass eine Standardkurve erforderlich ist.
Da es sich bei der ddPCR um eine aufstrebende Technik handelt, ist die visuelle Demonstration wichtig, um aktuellen und zukünftigen Anwendern zu helfen, Multiplex-Assays für den Nachweis von SARS-CoV-2 und anderen Krankheitserregern zu verstehen und einfach zu entwickeln. Für die cDNA-Synthese geben Sie zwei Mikroliter 5X Reverse Transkriptions-Mastermix, fünf Mikroliter der gewünschten RNA-Probe und drei Mikroliter RNase-freies, doppelt destilliertes Wasser in ein 100- oder 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen zu einem Endvolumen von 10 Mikrolitern als Lösung und legen Sie das Röhrchen auf Eis. Wenn die Reagenzien ausgeschaltet sind, laden Sie die Probe in einen Thermocycler und stellen Sie das Gerät so ein, dass es 15 Minuten lang eine reverse Transkription bei 37 Grad Celsius, eine Hitzeinaktivierung der reversen Transkription für 5 Sekunden bei 85 Grad Celsius und einen abschließenden unendlichen Halt bei vier Grad Celsius durchführt.
Bevor Sie eine digitale Tröpfchen-PCR durchführen, geben Sie 19,8 Mikroliter frisch zubereitete Mastermischung in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen einer nukleasefreien digitalen 96-Well-Tröpfchen-PCR-Platte. Geben Sie 2,2 Mikroliter cDNA in jede Vertiefung des Mastermixes, um ein Endvolumen von 22 Mikrolitern Reaktionsmischung pro Well zu erhalten, und versiegeln Sie die Platte mit einem Einweg-PCR-Plattenversiegeler. Wirbeln Sie die Platte dann 15 bis 30 Sekunden lang in der Zentrifuge für 10 bis 15 Sekunden, um den Wellinhalt am Boden der Platte zu sammeln.
Klicken Sie für die automatische Tröpfchenerzeugung auf dem Touchscreen des automatischen Tröpfchengenerators auf Probenplatte konfigurieren und wählen Sie die Spalten aus, in denen sich die Proben auf der Probenplatte befinden. Klicken Sie auf OK und öffnen Sie die Tür des automatischen Tröpfchengenerators. Legen Sie die Proben- und Tröpfchenerzeugungsplatten und die anderen für das Experiment erforderlichen Materialien an die entsprechenden Stellen im Gerät und schließen Sie die Tür.
Wenn der Touchscreen grün wird und damit anzeigt, dass alle Materialien in die richtige Position geladen wurden, wählen Sie das Öl für die Sonden aus und starten Sie die Tröpfchenerzeugung. Warten Sie, bis die Tröpfchenerzeugung gemäß der auf dem Bildschirm angezeigten Zeit abgeschlossen ist. Wenn auf dem Bildschirm "Tröpfchen bereit" angezeigt wird, öffnen Sie die Tür, um die Platte mit den Tröpfchen zu entfernen, und verwenden Sie fünf Sekunden lang bei 180 Grad Celsius eine Plattenversiegelung, um die Platte mit einer durchstechbaren Folienversiegelung zu versiegeln.
Legen Sie die versiegelte Tröpfchenplatte innerhalb von 30 Minuten nach der Tröpfchenerzeugung in einen 96-Deep-Well-Thermocycler. Stellen Sie das Probenvolumen auf 40 Mikroliter und die Deckeltemperatur auf 105 Grad Celsius ein. Anschließend werden die Tröpfchen mittels PCR vervielfältigt.
Übertragen Sie für die Tröpfchenlesung nach der Verstärkung die thermisch getaktete 96-Well-Platte in einen Tröpfchenleser und öffnen Sie die zugehörige Software auf einem Computer, der mit dem Tröpfchenlesegerät verbunden ist. Wählen Sie im Setup-Modus "Neu" und doppelklicken Sie auf ein beliebiges Well, um das Dialogfeld "Well-Editor" zu öffnen. Wählen Sie die zu lesenden Wells aus und stellen Sie das Experiment auf absolute Quantifizierung, Supermix auf Tröpfchen-Digital-PCR-Supermix für Sonden ein.
Richten Sie einen Typ auf Kanal 1 unbekannt und zwei Typen auf Kanal 2 unbekannt aus. Weisen Sie die Probennamen basierend auf dem Plattenlayout zu, und klicken Sie auf Anwenden und OK. Klicken Sie nach dem Speichern der Vorlage auf Ausführen.
Wenn Sie von der Software dazu aufgefordert werden, wählen Sie die FAM/HEX-Farbe aus. Entfernen Sie am Ende der Datenerfassung die Platte aus dem Lesegerät. Überprüfen Sie vor der Analyse der Daten die Daten aus allen Vertiefungen, um die Gesamtzahl der Tröpfchen zu ermitteln.
Und legen Sie einen Grenzwert fest, um eine Mindestanzahl von Tröpfchen zu akzeptieren, die als positive oder negative Ergebnisse gezählt werden. Für die Simplex- und Duplex-Assay-Analyse doppelklicken Sie auf die zu analysierende QLP-Datei und wählen Sie Analysieren. Verwenden Sie die Werkzeuge 1D-Amplitude und 2D-Amplitudenschwellenwert, um zwischen den positiven und negativen Tröpfchen für jedes Well im richtigen Kanal zu unterscheiden, wobei Sie die Knotenvorlagensteuerung und die Positivkontrollproben als Leitfaden verwenden.
Exportieren Sie dann die Ergebnisse als CSV-Datei zur weiteren Analyse. Öffnen Sie für einen Triplex-Sonden-Mix-Assay die QLP-Datei und wählen Sie die zu analysierenden Wells auf der Registerkarte des Platteneditors aus. Legen Sie den Experimenttyp auf direkte Quantifizierung und den zu untersuchenden Assay auf Triplex fest, und geben Sie den Zielnamen ein.
Klicken Sie dann auf Übernehmen. Verwenden Sie die Diagrammwerkzeuge, um verschiedenen Ziel-Clustern bestimmte Farben zuzuweisen, wie in den Popup-Vorschlägen des Fensters "Cluster auswählen" angegeben. Wenn alle Zielfarben zugewiesen wurden, werden die Quantifizierungsdaten im Well-Datenfenster angezeigt.
Exportieren Sie die Daten als CSV-Datei für die nachgelagerte Analyse. Stellen Sie für einen Quadruplex-Assay den Experimenttyp auf direkte Quantifizierung und den Assay auf Amplitudenmultiplex ein. Geben Sie den Zielnamen ein und klicken Sie auf Übernehmen.
Verwenden Sie die Diagrammwerkzeuge, um verschiedenen Ziel-Clustern bestimmte Farben zuzuweisen, wie in den Popup-Vorschlägen des Fensters "Cluster auswählen" angegeben. Wenn alle Zielfarben zugewiesen wurden, werden die Quantifizierungsdaten im Well-Datenfenster angezeigt. Exportieren Sie die Daten als CSV-Datei für weitere Analysen.
Wie in dieser repräsentativen Temperaturgradientenanalyse beobachtet wurde, konnten höhere kniende Temperaturen positive Tröpfchen nicht eindeutig von negativen Tröpfchen unterscheiden, wenn ein Duplex-Assay durchgeführt wurde. Mit einer Absenkung der Knietemperatur wurde jedoch eine optimale Trennung zwischen positiven und negativen Tröpfchen erreicht. Mit einem zweifarbigen digitalen RT-Tröpfchen-PCR-Detektionssystem ist es möglich, ein, zwei, drei und vier SARS-CoV-2-Ziele in einer einzigen Probe nachzuweisen.
Eine Kontrollprobe ohne Vorlage kann verwendet werden, um negative Tröpfchen zu lokalisieren, um den negativen Schwellenwert in Simplex-Assays festzulegen. Bei Duplex-Assays kann die Analyse in einzelnen Kanälen oder in der 2D-Amplitude durchgeführt werden. Obwohl die Datenanalyse von Multiplex-Assays höherer Ordnung nicht einfach ist, sind diese Assays nützlich, da sie die Bewertung von bis zu acht Tröpfchen-Clustern in Triplex-Sonden-Mix-Assays und bis zu 16 Tröpfchen-Clustern für Quadruplex-Amplituden-basierte Assays ermöglichen.
Stellen Sie je nach zu entwickelndem Assay sicher, dass dem Mastermix die richtigen Primer- und Sondenkonzentrationen des Ziels zugesetzt werden. Mit diesem Verfahren können die Targets abwechselnd verwendet werden, um neuartige RT-ddPCR-Assays zu entwickeln. Diese Assays können für verschiedene Forschungszwecke oder für die Diagnose neu auftretender Infektionskrankheiten verwendet werden.
Seit ihrer Entwicklung wird diese Technik zur genauen Bestimmung von viralen Nukleinsäurekopien in verschiedenen Standards, im menschlichen Körper und in Umweltproben eingesetzt.
