Die Autoren möchten die Advanced Optical Mikroskopie Facility (www.aomf.ca) an der Universität Health Network für die Unterstützung bei der Mikroskopie und Herr Jason Ellis von der Prinzessin Margaret Cancer Center Machine Shop zu danken für das WC-Herstellung und die Abbildungsstufe. Wir möchten auch Dr. Iris Kulbatski für Manuskript Bearbeitung danken.

HINWEIS: Bei allen Tier Arbeit wurde unter Protokoll # 2615 von der University Health Network Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt. 1. Chirurgische Vorbereitung der Maus <ol><li> Vor der Operation sterilisieren alle chirurgischen Instrumente und die Fensterkammer (WC) durch Autoklavieren. Ergänzen Sie die Trinkwasser mit 50 mg / kg Körpergewicht von Amoxicillin 2 Tage vor der Operation. Injizieren Sie die Maus mit 0,1 mg / kg Körpergewicht von Buprenorphin intraperitoneal 4 Stunden vor der Operation. </li><li> Anesthetize die athymischen Nacktmaus durch intraperitoneale Injektion von 350-400 &amp; mgr; l Salzlösung, die 80 mg / kg Ketamin und 13 mg / kg Xylazin (Hinweis: Diese von der Institutional Animal Care Committee genehmigt wurde, und wir haben keine Erfahrung mit negativen Auswirkungen gehabt ). Bestätigen Sie die richtige Anästhesie durch die Prüfung für Fussreflex. Weiter für Atmungsmuster, Schleimhautfarbe und Fussreflex während des Verfahrens zu beobachten. </li><li> Führen Sie die chirurgische procedures unter einem Biosicherheitsschrank sterilen Bedingungen während der Operation zu erhalten. Platzieren Sie die Maus auf einem elektrischen Heizkissen mit einem Operationstuch bedeckt auf Körpertemperatur während der Operation erhalten. Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter dem Stereomikroskop. </li><li> Tragen Sie Augensalbe, die Augen während der Operation feucht zu halten. Wiederholen erforderlich, wenn während des chirurgischen Eingriffs. Sterilisieren der Arbeitsbereich der Maus, indem sie mit 7,5% Povidon-Iod Abwischen, 70% Isopropylalkohol und 10% Povidon-Iod nacheinander und zweimal wiederholen dieses Verfahren. </li><li> Machen Sie eine 10 mm Längshautschnitt unter Verwendung von Skalpell mit einer Klinge (15 #), den Oberschenkelknochen von der lateralen Seite nähert. Setzen Sie die Oberschenkelknochen zwischen den Beuge- und Streckmuskeln durch stumpfe Dissektion Pinzette und hemostats mit Muskel-Funktionalität zu gewährleisten. </li><li> Legen Sie die U-förmigen Leiste unter dem Knochen, und installieren Sie das WC (Abbildung 1). Sichern Sie die Bar mit dem Fenster mit zwei Muttern und ziehen Sie die Muttern mit fürCEPS. Füllen Sie den Raum zwischen dem Knochen und dem WC mit Zahnzement. </li><li> Abzuschleifen den kortikalen Knochen in einer 6 x 2 mm 2 Bereich mit einem Mikrobohrer optischen Zugang zur Markhöhle zu gewinnen. Hinweis: Überprüfen Sie sorgfältig Verdünnung der kortikalen Knochen unter dem Mikroskop, während der Durchführung dieses Verfahrens. Lassen Sie eine intakte, fast transparente Periostschicht des Knochens. </li><li> Legen Sie die 8 mm Deckglas auf das Fenster, und sichern Sie das Deckglas mit einem Sprengring zu halten, an Ort und Stelle. </li><li> Stellen Sie die Muskulatur der Beuger und Strecker wieder an ihren ursprünglichen Standorten mit einer Zange mit ihrer Funktion nach der Operation zu erhalten. Nähen Sie die Dermis mit 5-0 Naht und einen Nadelhalter. </li><li> Überwachen Sie die Maus für die Wiederherstellung, bis er bei Bewusstsein ist und in der Lage, sich frei zu bewegen. Legen Sie das Tier in einen neuen Käfig, wenn erholt. </li><li> Nach der Wiederherstellung der Bildaufnahme auf das Tier noch am selben Tag oder den folgenden Tagen (siehe Abschnitt 2) durchführen. Überwachen Sie die physical Zustand täglich der Maus. Hinweis: Überwachen physikalischen Bedingungen, wie Gewicht auf Glied trägt, krümmte, schnellen oder flache Atmung, Hinterbeinschwellungen, Selbstverstümmelung, Cellulitis und schwere Dermatitis. </li><li> Geben intraperitoneale Injektion von 0,1 mg / kg Körpergewicht von Buprenorphin für 3 Tage und 1 mg / kg Körpergewicht von Meloxicam für 5 Tage nach der Operation für die Behandlung von postoperativen Schmerzen und Entzündungen. Weiter die Amoxicillin-ergänzt Wasser für 5 Tage bietet. </li><li> Am experimentellen Endpunkt, einschläfern das Tier von CO 2 Narkose durch eine sekundäre Methode gefolgt (zB Zervikaldislokation). </li></ol> 2. Bildaufnahme mit kombinierten Multi-Photonen-und konfokale Mikroskopie <ol><li> Vor der Bebilderung, betäuben die Maus durch intraperitoneale Injektion einer 350-400 &amp; mgr; l Kochsalzlösung, die 80 mg / kg Ketamin und 13 mg / kg Xylazin. Alternativ können inhalierbare Anästhetikum, wenn verfügbar.Bewerben Augensalbe. </li><li> Injizieren Sie die Mischung aus intravaskuläre Farbstoffe zur Markierung von Gefäßen (0,65 mg 2 MDa Fluorescein (FITC) -Dextran) und Neutrophilen (4 ug Allophycocyanin (APC) -Anti-Ly6G Antikörper). </li><li> Verwenden ein aufrechtes kombinierten Multiphotonen und konfokalen Mikroskop, ausgestattet mit einem Multiphotonen-Laserentfernungs 705-980 nm für die Zweiphotonenanregung sowie Einzelphotonen Laser, die Anregungswellenlängen von Blau bis Rot liefert. </li><li> Stellen Sie eine maßgeschneiderte Abbildungsstufe auf das Mikroskop (Abbildung 1B). Sichern Sie die Maus auf der Bühne durch die beiden Enden des WC-Klemm mit Krokodilklemmen. Hinweis: Kritische Komponenten der Phase sind: zwei Krokodilklemmen die WC zu halten, und ein Heizelement physiologischen Temperatur (37 ° C) der Maus, während der Bildgebung zu erhalten. </li><li> Schalten Sie die Zwei-Photonen-Laser und dem konfokalen System, und starten Sie die Bildaufnahme-Software von &quot;Start System&quot; klicken. Ein Fenster mit vier Registerkarten (Suchen,Beschaffung, Bearbeitung und Wartung) wird geöffnet. </li><li> Legen Sie die Imaging-Kanäle. Klicken Sie auf &quot;Smart Setup&quot; unter dem Acquisition Registerkarte und wählen Sie die Farbstoffe, die für die Bildgebung verwendet werden: FITC (488 nm Anregung, 493-588 nm Emission) und APC (633 nm Anregung und 638 bis 743 nm Emission). Wählen Sie &quot;Beste Signal&quot; und klicken Sie auf &quot;Übernehmen&quot;. </li><li> Fügen Sie die Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) Bildakquisitionskanal manuell. Schalten Sie die Zwei-Photonen-Laser unter dem &quot;Laser&quot; Fenster in der Acquisition Registerkarte. Unter der Kanäle-Fenster klicken Sie auf das &quot;+&quot; Zeichen einen Titel hinzuzufügen. </li><li> Stellen Sie die SHG-Spur auf. Ändern Sie die Wellenlänge 840 nm unter Kanäle Fenster, die nach oben und unten Pfeile, und wählen Sie den Erfassungsbereich von 415 bis 425 nm unter &quot;Light Path&quot; Fenster, um die Schieberegler verwenden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Okulare Online&quot; unter der Registerkarte Suchen. Klicken Sie auf FITC unter der Filtereinstellung für FITC den Bereich von Interesse zu betrachten und stellen Sie den Fokus manuell durch Drehen ter Fokusknopf auf der Seite des Mikroskops. Wenn die Region von Interesse befindet, klicken Sie auf &quot;Okulare offline&quot; unter der Registerkarte Suchen. </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte Acquisition. Wählen Sie FITC Spur unter Kanäle Fenster und klicken Sie auf &quot;Live&quot;, um das Bild von FITC-Dextran mit 5X Ziel der Vorschau anzeigen. Stellen Sie den Fokus, wenn nötig, und klicken Sie auf &quot;Stop&quot; unter Acquisition Registerkarte um die Vorschau zu stoppen. </li><li> drehen manuell zu 20X Wasser Ziel durch ein Rad über den Linsen zu bewegen. Sehen Sie das Bild wieder für FITC-Dextran die 20x-Objektiv mit und stellen Sie Master Gain und Pinhole unter der Kanäle Fenster optimales Signal und Kontrast zu erzielen. Wiederholen Sie für andere Kanäle, indem Sie APC und SHG-Tracks unter dem TV-Fenster. </li><li> Wählen Sie die Bildparameter. Klicken Sie auf &quot;Erfassungsmodus&quot; das Fenster zu öffnen. Stellen Sie die Bildgröße 1.024 x 1.024 Pixel zu sein, und Mittelung von 4X Bilder in hoher Qualität zu erhalten. </li><li> Erwerben Sie eine 2D-Snapshot. Wählen Sie alle Kanäle unter Kanäle gewinnenund dow klicken Sie auf &quot;Snap&quot; unter dem Reiter Acquisition. Prüfen Sie die Qualität des Bildes und Bildparameter ändern, wenn nötig. </li><li> Erwerben Sie 2D-Zeitraffer-Bild. <ol><li> Check &quot;Time Series&quot; in der Acquisition Registerkarte aus der Zeitreihenfenster zu öffnen. Geben Sie in 0 unter den Intervallen, und 40 für Gesamtzahl der Scans 40 Bilder kontinuierlich ohne Zeitintervall zu nehmen. Hinweis: 40 Scans etwa 5 Minuten lange Zeitreihen mit einer Scan-Geschwindigkeit von 7,5 sec / Rahmen und der Bildgröße von 600 um x 600 um erzeugt. Die Zeitabstände und die Anzahl von Abtastungen auf dem Mikroskop abhängig, Bildaufnahme-Einstellungen und der Bildrate der Kamera. Eine feste Intervallzeit (&gt; 0 sec) verwendet werden können Zeitrafferbilder aufgenommen zu verschiedenen Zeitpunkten zu vergleichen. Eine längere Zeitraffer-Bildgebung Dauer kann in Abhängigkeit von der erwarteten durchschnittlichen Geschwindigkeit von neutrophilen Granulozyten (oder andere Zellen von Interesse) in der experimentellen Bedingungen erforderlich. </li></ol></li><li> Erwerben Sie 3D-Bild.<ol><li> Check &quot;Z-Stack&quot; in der Acquisition Registerkarte aus der Z-Stack-Fenster zu öffnen. Starten Sie den &quot;Live&quot; Vorschaumodus für FITC-Dextran. Konzentrieren Sie sich auf der Oberseite der Probe und klicken Sie auf &quot;Set First&quot;, und konzentrieren sich auf das andere Ende der Probe und klicken Sie auf &quot;Set Last&quot; in der Z-Stack-Fenster. </li><li> Legen Sie das Intervall 10 &amp; mgr; m unter dem Z-Stack-Fenster sein. In Abhängigkeit von der ersten und der letzten in dem vorhergehenden Schritt ausgewählte optische Scheibe, wird diese 10-20 Scheiben erzeugen, mit optischen Gesamtdicke von 90-180 um auf. Hinweis: Die z-Stapelintervall von der Größe des Pinholes abhängig ist, die die Dicke der optischen Scheibe bestimmt. Das Intervall kleiner sein als die Dicke der optischen Schicht. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Start Experiment&quot; unter der Registerkarte Acquisition sammeln Bilder zu starten. </li></ol></li><li> Erwerben Sie 3D-Zeitraffer-Bild. <ol><li> Check &quot;Time Series&quot; und &quot;Z-Stack&quot; in der Acquisition Registerkarte aus der Zeitreihe zu öffnenund die Z-Stapel-Fenster. </li><li> Richten Sie die Zeitreihe und Z-Stapelaufnahmeparameter wie in den Schritten 2.14 und 2.15 beschrieben. Klicken Sie auf &quot;Start Experiment&quot; unter der Registerkarte Acquisition sammeln Bilder zu starten. </li></ol></li><li> Überwachen Sie die Maus während der Bildgebung, um sicherzustellen, es stabil und bewusstlos ist. Wenn die Maus während der Bildgebung instabil und / oder bei Bewusstsein ist, entfernen Sie die Maus von der Bühne, injizieren zusätzliche 100-150 ul der Anästhesielösung intraperitoneal und Bildgebung fortzusetzen. Hinweis: Zeichen der Instabilität sind schnelle Atmung und Bewegung der Maus, die als Verschiebung Artefakte in aufgenommenen Bildern zu sehen ist. </li><li> Nach der Bildaufnahme, nehmen Sie die Maus von der Bühne und wieder in den Käfig. Verwenden Sie eine Heizlampe es warm zu halten, und überwachen Sie die Maus, bis er bei Bewusstsein ist. </li></ol> 3. Bildanalyse und Quantifizierung <ol><li> Verwenden Sie die Bildanalyse-Software, um die 3D-und Zeitreihendaten zu analysieren. Öffnen Sie die Software undBilder hinzufügen, indem Sie sie in den offenen Bildschirm ziehen, die &quot;Arena&quot; Ansicht aufgerufen wird. Klicken Sie doppelt auf eine Bilddatei, es zu öffnen; das Bild wird unter &quot;Surpass&quot; Ansicht geöffnet werden. </li><li> Erstellen Sie ein 2D / 3D-Bild. <ol><li> Von der &quot;Mehr&quot; Bar auf der oberen rechten Ecke gefunden, klicken Sie auf &quot;Bearbeiten / Show Anzeige Einstellung&quot; &quot;Display-Einstellung&quot; Fenster zu öffnen. Optimieren Sie die Fluoreszenz-Anzeige durch die Schwellenwerte für jeden Kanal eingestellt wird, und eine Momentaufnahme um das Bild zu speichern. </li></ol></li><li> Generieren Objektspuren mit Zeitraffer-Bilder. <ol><li> Öffnen Sie das Bild analysiert werden unter &quot;Surpass&quot; Ansicht. Klicken Sie auf das Symbol mit einem Bild der orange Punkte, unterhalb der &quot;Surpass&quot; Symbol gefunden. Dadurch wird eine neue &quot;Spots&quot; Fenster zu öffnen. </li><li> Überprüfen Sie &quot;Track Spots (over Time)&quot; und klicken Sie auf den blauen Pfeil ab, um zum nächsten Schritt zu gehen. Wählen Sie den Kanal, die Objekte enthalten, unter &quot;Source Channel&quot; zu verfolgen, und stellen Sie die geschätzte Objekt diameter unter &quot;Geschätzte XY Durchmesser&quot; durch eine Zahl in der Eingabe. Klicken Sie auf den blauen Pfeil, um den nächsten Schritt zu gehen. Hinweis: Für die Neutrophilen-Tracking, wählen Sie den Kanal enthält APC Fluoreszenz für Neutrophile und stellen Sie den Objektdurchmesser bis 12 um basierend auf der bekannten Größe von Neutrophilen. </li><li> In dem Fenster finden und &quot;Qualität&quot; Filter auswählen, indem Sie auf den Pfeil nach unten klicken. Beachten Sie die von der Software definierten Stellen und stellen Sie die Schwelle manuell ein- oder Flecken auszuschließen. Sobald Schwelle definiert ist, klicken Sie auf den blauen Pfeil, um das &quot;Tracking&quot; Schritt zu gehen. </li><li> Bei Algorithmus, zu finden und &quot;Autoregressiven Motion-Algorithmus&quot; auswählen, indem Sie auf den Pfeil nach unten klicken. Typ in 10 &amp; mgr; m für &quot;Max Distance&quot; und 3 für &quot;Max Gap Size&quot; unter Parameter gefunden. Abhaken &quot;Lücken füllen mit allen erfassten Objekte&quot; Tracking zu starten, und klicken Sie auf den blauen Pfeil, um den nächsten Schritt zu gehen. Hinweis: &quot;Autoregressiven Bewegung Algorithmus&quot; verwendet wird foder Objekte, die Bewegung gerichtet haben, da sie Spuren erzeugt aus früheren Bewegung auf den vorhergesagten Standort. &quot;Max Distance&quot; und &quot;Max Gap Size&quot; kann auf der erwarteten Dimension und Geschwindigkeit des Objekts angepasst werden, je verfolgt wird, sowie die Gesamtdauer des Zeitraffer-Bild. </li><li> Unter Filtertyp, wählen Sie den Filter &quot;Track Dauer&quot;. Klicken Sie auf den grünen Pfeil Verfolgung zu beenden, und überprüfen Sie die Tracks, die generiert wurden. Gehen Sie zurück zum vorherigen Schritt bei Bedarf manuell die Titel sortieren. </li></ol></li><li> Wenn die erzeugten Zeitraffer-Bildverwehungen, richtig für die translationale Drift. <ol><li> Klicken Sie auf das Symbol mit einem Bild von einem Bleistift. Dies ist ein Register für das Editieren, die &quot;Titel bearbeiten&quot; öffnet sich. Untersuchen Sie die Zeitraffer-Bild und eine Referenzpunkt finden, die nicht für alle Bilder bewegen sollte. </li><li> In der linken oberen Ecke des Bildschirms finden &quot;Pointer&quot; Fenster und abhaken &quot;Select&quot; die cu zu aktivierenRSOR einen Platz für die Auswahl. Klicken Sie auf die der Referenzpunkt. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Richtig Drift&quot; im &quot;Edit Tracks&quot; Fenster. Abhaken &quot;Translational Drift&quot;. Die Software wird die korrigierte Reihe von Bildern automatisch generieren. </li></ol></li><li> zelluläre Bewegung durch die Objektspuren im Zeitraffer Bilder definiert messen. <ol><li> Unter dem &quot;Titel bearbeiten&quot; Fenster, abhaken &quot;Tracks&quot; und eine Spur wählen, die die Bewegung einer Zelle darstellt. Der ausgewählte Titel wird in gelb in der Zeitreihen-Bild hervorgehoben. </li><li> Klicken Sie auf das Symbol mit einem Bild eines Graphen, der die &quot;Statistik&quot; Fenster (Registerkarte Statistik) zu öffnen. </li><li> Unter &quot;Auswahl&quot;, wählen Sie &quot;Spur-Drehzahl-Mittelwert&quot;, indem Sie auf den Pfeil nach unten klicken, die Bahngeschwindigkeit für die ausgewählte Spur bedeuten zu erzeugen. Wählen Sie verschiedene Tracks und die Schritte wiederholen, um die Bahngeschwindigkeit für alle Zellen von Interesse bedeuten messen. </li></ol></li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M., Singh, S. R., Coppola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Genetics.">Mouse Genetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 289-312 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Echtzeit, Serien Abbildung der dynamischen zellulärer Prozesse in Knochenmark enthält Informationen, die sonst herausfordernd ist unter Verwendung herkömmlicher Techniken, wie beispielsweise die Histologie und die Gesamtblutwerte zu erhalten. Das Femur WC hier beschriebene Modell bietet einzigartige Möglichkeiten, zelluläre und strukturelle Veränderungen im Knochenmark im Laufe der Zeit zu untersuchen. Obwohl ein Femur WC Modell bereits berichtet wurde, unser neuartiges Design bietet eine größere Abbildungsfeld ...

Das Knochenmark ist ein wichtiges Organ beteiligt bei der Hämatopoese und Immunregulation. Es besteht aus einem hämatopoetischen Komponente hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und einem stromal Komponente , die nicht-hämatopoetischen Vorläuferzellen enthält, die zu Mesenchymzellen 1 ergeben. Zwei Drittel der hämatopoetischen Aktivität wird 2 auf die Erzeugung von myeloischen Zellen gewidmet. Insbesondere kann eine große Anzahl von Neutrophilen werden im Knochenmark produziert, mit 1-2 x 10 11 pro Tag erzeugten Zellen in einem normalen erwachsenen Menschen 2. Neutrophile sind die erste Verteidigungslinie gegen mikrobielle Infektionen und sind meist im Knochenmark reserviert , bis Stress ihre Mobilisierung löst peripheren Neutrophilen 1,3 zu ergänzen. Zusätzlich zu ihrer anti-mikrobiellen Wirkung, legen neuere Studien eine wichtige Rolle der Neutrophilen in der Krebsbiologie, sowohl pro- und mit anti-tumorigenen Phänotyp in Abhängigkeit von den transformierenden WachstumsFaktor beta (TGF-β) Signalisierung im Tumormikromilieu 4,5. Darüber hinaus zeigten Studien , dass Neutrophile , die in primären Tumoren anreichern ausüben pro-tumorigenen und metastatischen Wirkungen , die durch die zytotoxische Funktion von T - Zellen zu unterdrücken 6,7, während Neutrophilen im Umlauf eine zytotoxische, anti-metastatischen Effekt 8 ausüben. Als solche Untersuchung von hämatopoetischen Zellen im Knochenmark, insbesondere Neutrophilen, ist entscheidend ihre Rolle Regulierung in Immun- und Tumor Aufklären. Histopathologie und eine vollständige periphere Blutbild werden routinemßig 9 auszuwerten zelluläre und strukturelle Veränderungen im Knochenmark verwendet. Jedoch liefern diese Verfahren nur statische Informationen von verschiedenen Zellpopulationen oder Gewebemikrostrukturen. Längs in vivo Bildgebung kann mit den Standardverfahren in Kombination verwendet werden , um die Dynamik mehrerer zellulärer, vaskulären und stromalen Komponenten sowie von Zelle zu c zu beurteilenell-Wechselwirkungen in einer Längs Weise. Intravitalmikroskopie (IVM), definiert als Bildgebung der Tiere bei mikroskopischer Auflösung 10, leben , ist besonders nützlich für die in der gleichen Probe dynamische zelluläre Prozesse über die Zeit der Beurteilung, die Anzahl der Versuchstier erforderlich ist, verringert. IVM wird oft mit einer chronisch transplantierten Fensterkammer (WC) kombiniert, um das Organ von Interesse für die Bildgebung über einen Zeitraum von Wochen bis Monaten zuzugreifen. Schädel- und Rücken-skinfold WC-Modelle haben die längste Geschichte der Verwendung bis in die Mitte der 1990er Jahre zurückgehen. In jüngerer Zeit andere organspezifische WC Modelle wie diejenigen des Brustfettpolster und verschiedenen Unterleibsorgane wurden 11 entwickelt. Der typische Ansatz für die Bildgebung Knochenmark in vivo hat in erster Linie beteiligt Exposition der Schädelkalotte von Mäusen, in denen die ausgedünnten Knochen 14.12 direkte Visualisierung von Einzelzellen mit minimalen chirurgischen Eingriff ermöglicht. Jedoch kann der Calvaria bone marrow be verschieden von der anderer Knochen, wie beispielsweise die langen Knochen, wie durch eine geringere Anzahl von HSPCs und hypoxischen Zellen in Calvaria gezeigt, die 15 Wartung und Entwicklung von HSPCs reduziert anzeigt. Daher, alternative Ansätze für die Zellkomponenten in dem langen Knochen der Beurteilung untersucht. Dazu zählen direkte Exposition des Oberschenkelknochenmark 16 und ektopische Transplantation von Spalt Femur in der Rückenhaut WC 17. Jedoch ist die erstere eine Terminal Verfahren, das nicht Verfolgen von zellularen, strukturelle und funktionelle Veränderungen über längere Zeiträume erlaubt es, letztere wahrscheinlich stört die normale Knochenmarksfunktion aufgrund der Transplantation von Femur zu einer ektopischen Stelle innerhalb der dorsalen skinfold WC. Ein anderes Verfahren, das orthotope serielle Bildgebung von femoralen Knochenmark über die Zeit ermöglicht, ist die Verwendung eines WC in den Oberschenkelknochen. Ein früherer Bericht zeigte langfristige Bildgebung der Mikrozirkulation in der Oberschenkelknochenmark ein mitFemur WC in Mäusen 18. Darüber hinaus zeigten die Autoren Visualisierung von Tumorzellen in dem Femur, was anzeigt, seine Nützlichkeit in marrow Metastasierung Überwachung Knochen. Allerdings wurde diese WC-Design beschränkt durch seine Größe (1,2 cm Durchmesser) und relativ kleinen Abbildungsbereich (4 mm Durchmesser), die nur geeignet für große Mäuse war (26-34 g, 3-6 Monate alt) wodurch die Ansatz unpraktisch für den Routineeinsatz. Daher ist ein neues WC mit einer kleineren Gesamtgrße und größeren Innenabbildungsbereich wurde für die Zwecke dieser Studie entwickelt. Das Ziel dieser Studie war es, ein Verfahren bereitzustellen für verschiedene Zelltypen in dem femoralen Knochenmark-Bildgebung. Das Femur WC-Modell wurde im Haus entwickelt und wurde verwendet, Neutrophile innerhalb des 3D-Gefäßnetz zu visualisieren und zu verfolgen. Unter Verwendung dieses Modells IVM des Knochenmarks kann seriell über 40 Tage durchgeführt werden. Dieser Ansatz kann zur Erläuterung der Prozesse der Hämatopoese, Immunregulation eine auf einer Vielzahl von Gebieten angewendet werden,nd Tumorentwicklung.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>NRCNU-F athymic nude mice</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>Ncr nude</td>
			<td>8-10 weeks old, female</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>JB1302P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.&#160;</td>
			<td>DIN 01989529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td>
			<td>DIN 02169592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drape</td>
			<td>Proxima</td>
			<td>DYNJP2405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad</td>
			<td>Life Brand</td>
			<td>57800827375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment (tear gel)</td>
			<td>Novartis&#160;</td>
			<td>T296/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% betadine</td>
			<td>Purdue Frederick Co</td>
			<td>67618-151-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
			<td>GreenField</td>
			<td>P010IP7P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% betadine</td>
			<td>Purdue Frederick Co</td>
			<td>67618-150-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle (#3)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade (#15)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89176-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors curved</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>15023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baby-Mixter Hemostat</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito Hemostats</td>
			<td>Fine science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-drill</td>
			<td>Harvard Apparaus</td>
			<td>72-6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-drill burrs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femur window chamber</td>
			<td>PMCC machine shop</td>
			<td>custom design</td>
			<td>9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-shaped bar</td>
			<td>PMCC machine shop</td>
			<td>custom design</td>
			<td>13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass (8mm)</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>HBIO 64-0701 CS-8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring (8mm)</td>
			<td>ACKLANDS GRAINGER</td>
			<td>UNSPSC # 31163202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuts (hexagon stainless steel)</td>
			<td>Fastenal</td>
			<td>70701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement</td>
			<td>3M</td>
			<td>RelyX U200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (5-0 Monosof black)</td>
			<td>Covioien</td>
			<td>SN-5698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12501-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic)</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>DIN 0281251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim</td>
			<td>DIN 02240463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicillin (Clamavox)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>DIN 02027879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope LSM 710</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zeiss LSM 710 NLO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging stage</td>
			<td>PMCC machine shop</td>
			<td>custom design</td>
			<td>15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris 8.0</td>
			<td>Image analysis software described in Section 3 of the Protocol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 2012</td>
			<td>Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Murine femoral bone marrow erfolgreich zugegriffen , um die WC Verwendung Visualisierung einzelner Neutrophilen und Gefäßnetze zu ermöglichen. Figur 1 zeigt das WC Instrument und beschreibt die chirurgische Prozedur, die Exposition des Oberschenkelknochens und Ausdünnung der Kortikalis beinhaltet optischen Zugang im Inneren des zu gewinnen Knochen. Die Operation wird in den Mäusen gut vertragen; sie wurden für 5 Tage für negative körperliche Reaktionen, wie der h...

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Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Femur Fensterkammer Modell für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zelltracking im Knochenmark der Maus

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

femur-window-chamber-model-for-vivo-cell-tracking-murine-bone

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

8.1K Aufrufe.  Princess Margaret Cancer Centre. The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Serie: Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

In-vitro-Bildung von Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten<em&gt; In-vivo-</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murine Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection und Knochenmark-Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

Langfristig In Vivo Verfolgung von entzündlichen Zelldynamik in Drosophila Puppen

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Femur Fensterkammer Modell für

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