Name: femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow
Uploaded: 2016-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow at JoVE.com

Die Autoren möchten die Advanced Optical Mikroskopie Facility (www.aomf.ca) an der Universität Health Network für die Unterstützung bei der Mikroskopie und Herr Jason Ellis von der Prinzessin Margaret Cancer Center Machine Shop zu danken für das WC-Herstellung und die Abbildungsstufe. Wir möchten auch Dr. Iris Kulbatski für Manuskript Bearbeitung danken.

HINWEIS: Bei allen Tier Arbeit wurde unter Protokoll # 2615 von der University Health Network Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt. 1. Chirurgische Vorbereitung der Maus <ol><li> Vor der Operation sterilisieren alle chirurgischen Instrumente und die Fensterkammer (WC) durch Autoklavieren. Ergänzen Sie die Trinkwasser mit 50 mg / kg Körpergewicht von Amoxicillin 2 Tage vor der Operation. Injizieren Sie die Maus mit 0,1 mg / kg Körpergewicht von Buprenorphin intraperitoneal 4 Stunden vor der Operation. </li><li> Anesthetize die athymischen Nacktmaus durch intraperitoneale Injektion von 350-400 &amp; mgr; l Salzlösung, die 80 mg / kg Ketamin und 13 mg / kg Xylazin (Hinweis: Diese von der Institutional Animal Care Committee genehmigt wurde, und wir haben keine Erfahrung mit negativen Auswirkungen gehabt ). Bestätigen Sie die richtige Anästhesie durch die Prüfung für Fussreflex. Weiter für Atmungsmuster, Schleimhautfarbe und Fussreflex während des Verfahrens zu beobachten. </li><li> Führen Sie die chirurgische procedures unter einem Biosicherheitsschrank sterilen Bedingungen während der Operation zu erhalten. Platzieren Sie die Maus auf einem elektrischen Heizkissen mit einem Operationstuch bedeckt auf Körpertemperatur während der Operation erhalten. Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter dem Stereomikroskop. </li><li> Tragen Sie Augensalbe, die Augen während der Operation feucht zu halten. Wiederholen erforderlich, wenn während des chirurgischen Eingriffs. Sterilisieren der Arbeitsbereich der Maus, indem sie mit 7,5% Povidon-Iod Abwischen, 70% Isopropylalkohol und 10% Povidon-Iod nacheinander und zweimal wiederholen dieses Verfahren. </li><li> Machen Sie eine 10 mm Längshautschnitt unter Verwendung von Skalpell mit einer Klinge (15 #), den Oberschenkelknochen von der lateralen Seite nähert. Setzen Sie die Oberschenkelknochen zwischen den Beuge- und Streckmuskeln durch stumpfe Dissektion Pinzette und hemostats mit Muskel-Funktionalität zu gewährleisten. </li><li> Legen Sie die U-förmigen Leiste unter dem Knochen, und installieren Sie das WC (Abbildung 1). Sichern Sie die Bar mit dem Fenster mit zwei Muttern und ziehen Sie die Muttern mit fürCEPS. Füllen Sie den Raum zwischen dem Knochen und dem WC mit Zahnzement. </li><li> Abzuschleifen den kortikalen Knochen in einer 6 x 2 mm 2 Bereich mit einem Mikrobohrer optischen Zugang zur Markhöhle zu gewinnen. Hinweis: Überprüfen Sie sorgfältig Verdünnung der kortikalen Knochen unter dem Mikroskop, während der Durchführung dieses Verfahrens. Lassen Sie eine intakte, fast transparente Periostschicht des Knochens. </li><li> Legen Sie die 8 mm Deckglas auf das Fenster, und sichern Sie das Deckglas mit einem Sprengring zu halten, an Ort und Stelle. </li><li> Stellen Sie die Muskulatur der Beuger und Strecker wieder an ihren ursprünglichen Standorten mit einer Zange mit ihrer Funktion nach der Operation zu erhalten. Nähen Sie die Dermis mit 5-0 Naht und einen Nadelhalter. </li><li> Überwachen Sie die Maus für die Wiederherstellung, bis er bei Bewusstsein ist und in der Lage, sich frei zu bewegen. Legen Sie das Tier in einen neuen Käfig, wenn erholt. </li><li> Nach der Wiederherstellung der Bildaufnahme auf das Tier noch am selben Tag oder den folgenden Tagen (siehe Abschnitt 2) durchführen. Überwachen Sie die physical Zustand täglich der Maus. Hinweis: Überwachen physikalischen Bedingungen, wie Gewicht auf Glied trägt, krümmte, schnellen oder flache Atmung, Hinterbeinschwellungen, Selbstverstümmelung, Cellulitis und schwere Dermatitis. </li><li> Geben intraperitoneale Injektion von 0,1 mg / kg Körpergewicht von Buprenorphin für 3 Tage und 1 mg / kg Körpergewicht von Meloxicam für 5 Tage nach der Operation für die Behandlung von postoperativen Schmerzen und Entzündungen. Weiter die Amoxicillin-ergänzt Wasser für 5 Tage bietet. </li><li> Am experimentellen Endpunkt, einschläfern das Tier von CO 2 Narkose durch eine sekundäre Methode gefolgt (zB Zervikaldislokation). </li></ol> 2. Bildaufnahme mit kombinierten Multi-Photonen-und konfokale Mikroskopie <ol><li> Vor der Bebilderung, betäuben die Maus durch intraperitoneale Injektion einer 350-400 &amp; mgr; l Kochsalzlösung, die 80 mg / kg Ketamin und 13 mg / kg Xylazin. Alternativ können inhalierbare Anästhetikum, wenn verfügbar.Bewerben Augensalbe. </li><li> Injizieren Sie die Mischung aus intravaskuläre Farbstoffe zur Markierung von Gefäßen (0,65 mg 2 MDa Fluorescein (FITC) -Dextran) und Neutrophilen (4 ug Allophycocyanin (APC) -Anti-Ly6G Antikörper). </li><li> Verwenden ein aufrechtes kombinierten Multiphotonen und konfokalen Mikroskop, ausgestattet mit einem Multiphotonen-Laserentfernungs 705-980 nm für die Zweiphotonenanregung sowie Einzelphotonen Laser, die Anregungswellenlängen von Blau bis Rot liefert. </li><li> Stellen Sie eine maßgeschneiderte Abbildungsstufe auf das Mikroskop (Abbildung 1B). Sichern Sie die Maus auf der Bühne durch die beiden Enden des WC-Klemm mit Krokodilklemmen. Hinweis: Kritische Komponenten der Phase sind: zwei Krokodilklemmen die WC zu halten, und ein Heizelement physiologischen Temperatur (37 ° C) der Maus, während der Bildgebung zu erhalten. </li><li> Schalten Sie die Zwei-Photonen-Laser und dem konfokalen System, und starten Sie die Bildaufnahme-Software von &quot;Start System&quot; klicken. Ein Fenster mit vier Registerkarten (Suchen,Beschaffung, Bearbeitung und Wartung) wird geöffnet. </li><li> Legen Sie die Imaging-Kanäle. Klicken Sie auf &quot;Smart Setup&quot; unter dem Acquisition Registerkarte und wählen Sie die Farbstoffe, die für die Bildgebung verwendet werden: FITC (488 nm Anregung, 493-588 nm Emission) und APC (633 nm Anregung und 638 bis 743 nm Emission). Wählen Sie &quot;Beste Signal&quot; und klicken Sie auf &quot;Übernehmen&quot;. </li><li> Fügen Sie die Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) Bildakquisitionskanal manuell. Schalten Sie die Zwei-Photonen-Laser unter dem &quot;Laser&quot; Fenster in der Acquisition Registerkarte. Unter der Kanäle-Fenster klicken Sie auf das &quot;+&quot; Zeichen einen Titel hinzuzufügen. </li><li> Stellen Sie die SHG-Spur auf. Ändern Sie die Wellenlänge 840 nm unter Kanäle Fenster, die nach oben und unten Pfeile, und wählen Sie den Erfassungsbereich von 415 bis 425 nm unter &quot;Light Path&quot; Fenster, um die Schieberegler verwenden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Okulare Online&quot; unter der Registerkarte Suchen. Klicken Sie auf FITC unter der Filtereinstellung für FITC den Bereich von Interesse zu betrachten und stellen Sie den Fokus manuell durch Drehen ter Fokusknopf auf der Seite des Mikroskops. Wenn die Region von Interesse befindet, klicken Sie auf &quot;Okulare offline&quot; unter der Registerkarte Suchen. </li><li> Klicken Sie auf die Registerkarte Acquisition. Wählen Sie FITC Spur unter Kanäle Fenster und klicken Sie auf &quot;Live&quot;, um das Bild von FITC-Dextran mit 5X Ziel der Vorschau anzeigen. Stellen Sie den Fokus, wenn nötig, und klicken Sie auf &quot;Stop&quot; unter Acquisition Registerkarte um die Vorschau zu stoppen. </li><li> drehen manuell zu 20X Wasser Ziel durch ein Rad über den Linsen zu bewegen. Sehen Sie das Bild wieder für FITC-Dextran die 20x-Objektiv mit und stellen Sie Master Gain und Pinhole unter der Kanäle Fenster optimales Signal und Kontrast zu erzielen. Wiederholen Sie für andere Kanäle, indem Sie APC und SHG-Tracks unter dem TV-Fenster. </li><li> Wählen Sie die Bildparameter. Klicken Sie auf &quot;Erfassungsmodus&quot; das Fenster zu öffnen. Stellen Sie die Bildgröße 1.024 x 1.024 Pixel zu sein, und Mittelung von 4X Bilder in hoher Qualität zu erhalten. </li><li> Erwerben Sie eine 2D-Snapshot. Wählen Sie alle Kanäle unter Kanäle gewinnenund dow klicken Sie auf &quot;Snap&quot; unter dem Reiter Acquisition. Prüfen Sie die Qualität des Bildes und Bildparameter ändern, wenn nötig. </li><li> Erwerben Sie 2D-Zeitraffer-Bild. <ol><li> Check &quot;Time Series&quot; in der Acquisition Registerkarte aus der Zeitreihenfenster zu öffnen. Geben Sie in 0 unter den Intervallen, und 40 für Gesamtzahl der Scans 40 Bilder kontinuierlich ohne Zeitintervall zu nehmen. Hinweis: 40 Scans etwa 5 Minuten lange Zeitreihen mit einer Scan-Geschwindigkeit von 7,5 sec / Rahmen und der Bildgröße von 600 um x 600 um erzeugt. Die Zeitabstände und die Anzahl von Abtastungen auf dem Mikroskop abhängig, Bildaufnahme-Einstellungen und der Bildrate der Kamera. Eine feste Intervallzeit (&gt; 0 sec) verwendet werden können Zeitrafferbilder aufgenommen zu verschiedenen Zeitpunkten zu vergleichen. Eine längere Zeitraffer-Bildgebung Dauer kann in Abhängigkeit von der erwarteten durchschnittlichen Geschwindigkeit von neutrophilen Granulozyten (oder andere Zellen von Interesse) in der experimentellen Bedingungen erforderlich. </li></ol></li><li> Erwerben Sie 3D-Bild.<ol><li> Check &quot;Z-Stack&quot; in der Acquisition Registerkarte aus der Z-Stack-Fenster zu öffnen. Starten Sie den &quot;Live&quot; Vorschaumodus für FITC-Dextran. Konzentrieren Sie sich auf der Oberseite der Probe und klicken Sie auf &quot;Set First&quot;, und konzentrieren sich auf das andere Ende der Probe und klicken Sie auf &quot;Set Last&quot; in der Z-Stack-Fenster. </li><li> Legen Sie das Intervall 10 &amp; mgr; m unter dem Z-Stack-Fenster sein. In Abhängigkeit von der ersten und der letzten in dem vorhergehenden Schritt ausgewählte optische Scheibe, wird diese 10-20 Scheiben erzeugen, mit optischen Gesamtdicke von 90-180 um auf. Hinweis: Die z-Stapelintervall von der Größe des Pinholes abhängig ist, die die Dicke der optischen Scheibe bestimmt. Das Intervall kleiner sein als die Dicke der optischen Schicht. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Start Experiment&quot; unter der Registerkarte Acquisition sammeln Bilder zu starten. </li></ol></li><li> Erwerben Sie 3D-Zeitraffer-Bild. <ol><li> Check &quot;Time Series&quot; und &quot;Z-Stack&quot; in der Acquisition Registerkarte aus der Zeitreihe zu öffnenund die Z-Stapel-Fenster. </li><li> Richten Sie die Zeitreihe und Z-Stapelaufnahmeparameter wie in den Schritten 2.14 und 2.15 beschrieben. Klicken Sie auf &quot;Start Experiment&quot; unter der Registerkarte Acquisition sammeln Bilder zu starten. </li></ol></li><li> Überwachen Sie die Maus während der Bildgebung, um sicherzustellen, es stabil und bewusstlos ist. Wenn die Maus während der Bildgebung instabil und / oder bei Bewusstsein ist, entfernen Sie die Maus von der Bühne, injizieren zusätzliche 100-150 ul der Anästhesielösung intraperitoneal und Bildgebung fortzusetzen. Hinweis: Zeichen der Instabilität sind schnelle Atmung und Bewegung der Maus, die als Verschiebung Artefakte in aufgenommenen Bildern zu sehen ist. </li><li> Nach der Bildaufnahme, nehmen Sie die Maus von der Bühne und wieder in den Käfig. Verwenden Sie eine Heizlampe es warm zu halten, und überwachen Sie die Maus, bis er bei Bewusstsein ist. </li></ol> 3. Bildanalyse und Quantifizierung <ol><li> Verwenden Sie die Bildanalyse-Software, um die 3D-und Zeitreihendaten zu analysieren. Öffnen Sie die Software undBilder hinzufügen, indem Sie sie in den offenen Bildschirm ziehen, die &quot;Arena&quot; Ansicht aufgerufen wird. Klicken Sie doppelt auf eine Bilddatei, es zu öffnen; das Bild wird unter &quot;Surpass&quot; Ansicht geöffnet werden. </li><li> Erstellen Sie ein 2D / 3D-Bild. <ol><li> Von der &quot;Mehr&quot; Bar auf der oberen rechten Ecke gefunden, klicken Sie auf &quot;Bearbeiten / Show Anzeige Einstellung&quot; &quot;Display-Einstellung&quot; Fenster zu öffnen. Optimieren Sie die Fluoreszenz-Anzeige durch die Schwellenwerte für jeden Kanal eingestellt wird, und eine Momentaufnahme um das Bild zu speichern. </li></ol></li><li> Generieren Objektspuren mit Zeitraffer-Bilder. <ol><li> Öffnen Sie das Bild analysiert werden unter &quot;Surpass&quot; Ansicht. Klicken Sie auf das Symbol mit einem Bild der orange Punkte, unterhalb der &quot;Surpass&quot; Symbol gefunden. Dadurch wird eine neue &quot;Spots&quot; Fenster zu öffnen. </li><li> Überprüfen Sie &quot;Track Spots (over Time)&quot; und klicken Sie auf den blauen Pfeil ab, um zum nächsten Schritt zu gehen. Wählen Sie den Kanal, die Objekte enthalten, unter &quot;Source Channel&quot; zu verfolgen, und stellen Sie die geschätzte Objekt diameter unter &quot;Geschätzte XY Durchmesser&quot; durch eine Zahl in der Eingabe. Klicken Sie auf den blauen Pfeil, um den nächsten Schritt zu gehen. Hinweis: Für die Neutrophilen-Tracking, wählen Sie den Kanal enthält APC Fluoreszenz für Neutrophile und stellen Sie den Objektdurchmesser bis 12 um basierend auf der bekannten Größe von Neutrophilen. </li><li> In dem Fenster finden und &quot;Qualität&quot; Filter auswählen, indem Sie auf den Pfeil nach unten klicken. Beachten Sie die von der Software definierten Stellen und stellen Sie die Schwelle manuell ein- oder Flecken auszuschließen. Sobald Schwelle definiert ist, klicken Sie auf den blauen Pfeil, um das &quot;Tracking&quot; Schritt zu gehen. </li><li> Bei Algorithmus, zu finden und &quot;Autoregressiven Motion-Algorithmus&quot; auswählen, indem Sie auf den Pfeil nach unten klicken. Typ in 10 &amp; mgr; m für &quot;Max Distance&quot; und 3 für &quot;Max Gap Size&quot; unter Parameter gefunden. Abhaken &quot;Lücken füllen mit allen erfassten Objekte&quot; Tracking zu starten, und klicken Sie auf den blauen Pfeil, um den nächsten Schritt zu gehen. Hinweis: &quot;Autoregressiven Bewegung Algorithmus&quot; verwendet wird foder Objekte, die Bewegung gerichtet haben, da sie Spuren erzeugt aus früheren Bewegung auf den vorhergesagten Standort. &quot;Max Distance&quot; und &quot;Max Gap Size&quot; kann auf der erwarteten Dimension und Geschwindigkeit des Objekts angepasst werden, je verfolgt wird, sowie die Gesamtdauer des Zeitraffer-Bild. </li><li> Unter Filtertyp, wählen Sie den Filter &quot;Track Dauer&quot;. Klicken Sie auf den grünen Pfeil Verfolgung zu beenden, und überprüfen Sie die Tracks, die generiert wurden. Gehen Sie zurück zum vorherigen Schritt bei Bedarf manuell die Titel sortieren. </li></ol></li><li> Wenn die erzeugten Zeitraffer-Bildverwehungen, richtig für die translationale Drift. <ol><li> Klicken Sie auf das Symbol mit einem Bild von einem Bleistift. Dies ist ein Register für das Editieren, die &quot;Titel bearbeiten&quot; öffnet sich. Untersuchen Sie die Zeitraffer-Bild und eine Referenzpunkt finden, die nicht für alle Bilder bewegen sollte. </li><li> In der linken oberen Ecke des Bildschirms finden &quot;Pointer&quot; Fenster und abhaken &quot;Select&quot; die cu zu aktivierenRSOR einen Platz für die Auswahl. Klicken Sie auf die der Referenzpunkt. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Richtig Drift&quot; im &quot;Edit Tracks&quot; Fenster. Abhaken &quot;Translational Drift&quot;. Die Software wird die korrigierte Reihe von Bildern automatisch generieren. </li></ol></li><li> zelluläre Bewegung durch die Objektspuren im Zeitraffer Bilder definiert messen. <ol><li> Unter dem &quot;Titel bearbeiten&quot; Fenster, abhaken &quot;Tracks&quot; und eine Spur wählen, die die Bewegung einer Zelle darstellt. Der ausgewählte Titel wird in gelb in der Zeitreihen-Bild hervorgehoben. </li><li> Klicken Sie auf das Symbol mit einem Bild eines Graphen, der die &quot;Statistik&quot; Fenster (Registerkarte Statistik) zu öffnen. </li><li> Unter &quot;Auswahl&quot;, wählen Sie &quot;Spur-Drehzahl-Mittelwert&quot;, indem Sie auf den Pfeil nach unten klicken, die Bahngeschwindigkeit für die ausgewählte Spur bedeuten zu erzeugen. Wählen Sie verschiedene Tracks und die Schritte wiederholen, um die Bahngeschwindigkeit für alle Zellen von Interesse bedeuten messen. </li></ol></li></ol>

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Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation:+a+comprehensive+review.">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+femoral+segmental+defect+model+for+bone+tissue+engineering+using+a+novel+rigid+internal+fixation+system.">A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system.</a> J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+bone,+hemopoietic+stem+cells,+and+vasculature.">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M., Singh, S. R., Coppola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Genetics.">Mouse Genetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 289-312 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Echtzeit, Serien Abbildung der dynamischen zellulärer Prozesse in Knochenmark enthält Informationen, die sonst herausfordernd ist unter Verwendung herkömmlicher Techniken, wie beispielsweise die Histologie und die Gesamtblutwerte zu erhalten. Das Femur WC hier beschriebene Modell bietet einzigartige Möglichkeiten, zelluläre und strukturelle Veränderungen im Knochenmark im Laufe der Zeit zu untersuchen. Obwohl ein Femur WC Modell bereits berichtet wurde, unser neuartiges Design bietet eine größere Abbildungsfeld ...

Das Knochenmark ist ein wichtiges Organ beteiligt bei der Hämatopoese und Immunregulation. Es besteht aus einem hämatopoetischen Komponente hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und einem stromal Komponente , die nicht-hämatopoetischen Vorläuferzellen enthält, die zu Mesenchymzellen 1 ergeben. Zwei Drittel der hämatopoetischen Aktivität wird 2 auf die Erzeugung von myeloischen Zellen gewidmet. Insbesondere kann eine große Anzahl von Neutrophilen werden im Knochenmark produziert, mit 1-2 x 10 11 pro Tag erzeugten Zellen in einem normalen erwachsenen Menschen 2. Neutrophile sind die erste Verteidigungslinie gegen mikrobielle Infektionen und sind meist im Knochenmark reserviert , bis Stress ihre Mobilisierung löst peripheren Neutrophilen 1,3 zu ergänzen. Zusätzlich zu ihrer anti-mikrobiellen Wirkung, legen neuere Studien eine wichtige Rolle der Neutrophilen in der Krebsbiologie, sowohl pro- und mit anti-tumorigenen Phänotyp in Abhängigkeit von den transformierenden WachstumsFaktor beta (TGF-β) Signalisierung im Tumormikromilieu 4,5. Darüber hinaus zeigten Studien , dass Neutrophile , die in primären Tumoren anreichern ausüben pro-tumorigenen und metastatischen Wirkungen , die durch die zytotoxische Funktion von T - Zellen zu unterdrücken 6,7, während Neutrophilen im Umlauf eine zytotoxische, anti-metastatischen Effekt 8 ausüben. Als solche Untersuchung von hämatopoetischen Zellen im Knochenmark, insbesondere Neutrophilen, ist entscheidend ihre Rolle Regulierung in Immun- und Tumor Aufklären. Histopathologie und eine vollständige periphere Blutbild werden routinemßig 9 auszuwerten zelluläre und strukturelle Veränderungen im Knochenmark verwendet. Jedoch liefern diese Verfahren nur statische Informationen von verschiedenen Zellpopulationen oder Gewebemikrostrukturen. Längs in vivo Bildgebung kann mit den Standardverfahren in Kombination verwendet werden , um die Dynamik mehrerer zellulärer, vaskulären und stromalen Komponenten sowie von Zelle zu c zu beurteilenell-Wechselwirkungen in einer Längs Weise. Intravitalmikroskopie (IVM), definiert als Bildgebung der Tiere bei mikroskopischer Auflösung 10, leben , ist besonders nützlich für die in der gleichen Probe dynamische zelluläre Prozesse über die Zeit der Beurteilung, die Anzahl der Versuchstier erforderlich ist, verringert. IVM wird oft mit einer chronisch transplantierten Fensterkammer (WC) kombiniert, um das Organ von Interesse für die Bildgebung über einen Zeitraum von Wochen bis Monaten zuzugreifen. Schädel- und Rücken-skinfold WC-Modelle haben die längste Geschichte der Verwendung bis in die Mitte der 1990er Jahre zurückgehen. In jüngerer Zeit andere organspezifische WC Modelle wie diejenigen des Brustfettpolster und verschiedenen Unterleibsorgane wurden 11 entwickelt. Der typische Ansatz für die Bildgebung Knochenmark in vivo hat in erster Linie beteiligt Exposition der Schädelkalotte von Mäusen, in denen die ausgedünnten Knochen 14.12 direkte Visualisierung von Einzelzellen mit minimalen chirurgischen Eingriff ermöglicht. Jedoch kann der Calvaria bone marrow be verschieden von der anderer Knochen, wie beispielsweise die langen Knochen, wie durch eine geringere Anzahl von HSPCs und hypoxischen Zellen in Calvaria gezeigt, die 15 Wartung und Entwicklung von HSPCs reduziert anzeigt. Daher, alternative Ansätze für die Zellkomponenten in dem langen Knochen der Beurteilung untersucht. Dazu zählen direkte Exposition des Oberschenkelknochenmark 16 und ektopische Transplantation von Spalt Femur in der Rückenhaut WC 17. Jedoch ist die erstere eine Terminal Verfahren, das nicht Verfolgen von zellularen, strukturelle und funktionelle Veränderungen über längere Zeiträume erlaubt es, letztere wahrscheinlich stört die normale Knochenmarksfunktion aufgrund der Transplantation von Femur zu einer ektopischen Stelle innerhalb der dorsalen skinfold WC. Ein anderes Verfahren, das orthotope serielle Bildgebung von femoralen Knochenmark über die Zeit ermöglicht, ist die Verwendung eines WC in den Oberschenkelknochen. Ein früherer Bericht zeigte langfristige Bildgebung der Mikrozirkulation in der Oberschenkelknochenmark ein mitFemur WC in Mäusen 18. Darüber hinaus zeigten die Autoren Visualisierung von Tumorzellen in dem Femur, was anzeigt, seine Nützlichkeit in marrow Metastasierung Überwachung Knochen. Allerdings wurde diese WC-Design beschränkt durch seine Größe (1,2 cm Durchmesser) und relativ kleinen Abbildungsbereich (4 mm Durchmesser), die nur geeignet für große Mäuse war (26-34 g, 3-6 Monate alt) wodurch die Ansatz unpraktisch für den Routineeinsatz. Daher ist ein neues WC mit einer kleineren Gesamtgrße und größeren Innenabbildungsbereich wurde für die Zwecke dieser Studie entwickelt. Das Ziel dieser Studie war es, ein Verfahren bereitzustellen für verschiedene Zelltypen in dem femoralen Knochenmark-Bildgebung. Das Femur WC-Modell wurde im Haus entwickelt und wurde verwendet, Neutrophile innerhalb des 3D-Gefäßnetz zu visualisieren und zu verfolgen. Unter Verwendung dieses Modells IVM des Knochenmarks kann seriell über 40 Tage durchgeführt werden. Dieser Ansatz kann zur Erläuterung der Prozesse der Hämatopoese, Immunregulation eine auf einer Vielzahl von Gebieten angewendet werden,nd Tumorentwicklung.

<table><tbody><tr><td>NRCNU-F athymic nude mice</td><td>Taconic</td><td>Ncr nude</td><td>8-10 weeks old, female</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>JB1302P</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.&amp;nbsp;</td><td>DIN 01989529</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>Surgical drape</td><td>Proxima</td><td>DYNJP2405</td><td></td></tr><tr><td>Electric heating pad</td><td>Life Brand</td><td>57800827375</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>Leica M60</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment (tear gel)</td><td>Novartis&amp;nbsp;</td><td>T296/2</td><td></td></tr><tr><td>7.5% betadine</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>70% isopropyl alcohol</td><td>GreenField</td><td>P010IP7P</td><td></td></tr><tr><td>10% betadine</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-150-05</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle (#3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade (#15)</td><td>VWR</td><td>89176-368</td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors curved</td><td>Fine science Tools</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Baby-Mixter Hemostat</td><td>Fine science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps</td><td>Fine science Tools</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hemostats</td><td>Fine science Tools</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>Micro-drill</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6065</td><td></td></tr><tr><td>Micro-drill burrs</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-14</td><td></td></tr><tr><td>Femur window chamber</td><td>PMCC machine shop</td><td>custom design</td><td>9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness)</td></tr><tr><td>U-shaped bar</td><td>PMCC machine shop</td><td>custom design</td><td>13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height)</td></tr><tr><td>Coverglass (8 mm)</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>HBIO 64-0701 CS-8R</td><td></td></tr><tr><td>Retaining ring (8 mm)</td><td>ACKLANDS GRAINGER</td><td>UNSPSC # 31163202</td><td></td></tr><tr><td>Nuts (hexagon stainless steel)</td><td>Fastenal</td><td>70701</td><td></td></tr><tr><td>Dental cement</td><td>3M</td><td>RelyX U200</td><td></td></tr><tr><td>Suture (5-0 Monosof black)</td><td>Covioien</td><td>SN-5698</td><td></td></tr><tr><td>Halsey needle holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12501-13</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine (Temgesic)</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>DIN 0281251</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (Metacam)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>DIN 02240463</td><td></td></tr><tr><td>Amoxicillin (Clamavox)</td><td>Pfizer</td><td>DIN 02027879</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-9668</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td></td></tr><tr><td>Imaging stage</td><td>PMCC machine shop</td><td>custom design</td><td>15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height)</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane</td><td>Imaris 8.0</td><td>Image analysis software described in Section 3 of the Protocol&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Zen 2012</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2012</td><td>Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Murine femoral bone marrow erfolgreich zugegriffen , um die WC Verwendung Visualisierung einzelner Neutrophilen und Gefäßnetze zu ermöglichen. Figur 1 zeigt das WC Instrument und beschreibt die chirurgische Prozedur, die Exposition des Oberschenkelknochens und Ausdünnung der Kortikalis beinhaltet optischen Zugang im Inneren des zu gewinnen Knochen. Die Operation wird in den Mäusen gut vertragen; sie wurden für 5 Tage für negative körperliche Reaktionen, wie der h...

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Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Femur Fensterkammer Modell für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zelltracking im Knochenmark der Maus

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

8.2K Aufrufe.  Princess Margaret Cancer Centre. The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Serie: Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Automatisierte Quantifizierung Hämatopoetische Zell - Stromal Cell Interactions in histologische Bilder unentkalkte Knochen

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular niches modulating critical hematopoietic stem cell (HSC) functions1,2. Indeed, a more detailed picture of the hematopoietic microenvironment is now emerging, in which the endosteal and the endothelial niches form functional units for the regulation of normal HSC and their progeny3,4,5. New studies have revealed the importance of perivascular cells, adipocytes and neuronal cells in maintaining and regulating HSC function6,7,8. Furthermore, there is evidence that cells from different lineages, i.e. myeloid and lymphoid cells, home and reside in specific niches within the BM microenvironment. However, a complete mapping of the BM microenvironment and its occupants is still in progress.
Transgenic mouse strains expressing lineage specific fluorescent markers or mice genetically engineered to lack selected molecules in specific cells of the BM niche are now available. Knock-out and lineage tracking models, in combination with transplantation approaches, provide the opportunity to refine the knowledge on the role of specific &#34;niche&#34; cells for defined hematopoietic populations, such as HSC, B-cells, T-cells, myeloid cells and erythroid cells. This strategy can be further potentiated by merging the use of two-photon microscopy of the calvarium. By providing in vivo high resolution imaging and 3-D rendering of the BM calvarium, we can now determine precisely the location where specific hematopoietic subsets home in the BM and evaluate the kinetics of their expansion over time. Here, Lys-GFP transgenic mice (marking myeloid cells)9 and RBPJ knock-out mice (lacking canonical Notch signaling)10 are used in combination with IVFM to determine the engraftment of myeloid cells to a Notch defective BM microenvironment.

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Intravital fluorescence microscopy (IVFM) of the calvarium is applied in combination with genetic animal models to study the homing and engraftment of hematopoietic cells into bone marrow (BM) niches.

Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten<em&gt; In-vivo-</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Immunologie und Infektion

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Oberschenkelknochenmark-Aspiration im Live-Mäuse

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Medizin

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murine Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection und Knochenmark-Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Biologie

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

<meta charset="utf8"></head><body>Intrafemorale Injektion für Knochenmarkstudie an lebenden Mäusen

Simplified Intrafemoral Injections Using Live Mice Allow for Continuous Bone Marrow Analysis

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. In murine models, this technique has been adapted to enhance the seeding efficiency of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This paper describes a detailed step-by-step technical procedure of IF injection and the following bone marrow (BM) aspiration in mice that allows for serial characterization of cells present in the BM. This method enables the transplantation of valuable samples with low cell numbers that are particularly difficult to engraft by intravenous injection. This procedure facilitates the creation of xenografts that are critical for pathological analysis. While it is easier to access peripheral blood (PB), the cellular composition of PB does not reflect the BM, which is the niche for HSPCs. Therefore, procedures providing access to the BM compartment are essential for studying hematopoiesis. IF injection and serial BM aspiration, as described here, allow for the prospective retrieval and characterization of cells enriched in the BM, such as HSPCs, without sacrificing the mice.

<meta charset="utf8"></head><body>Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

This protocol describes the intrafemoral injection of a few hematopoietic or leukemic stem cells, including gene-edited cells, in murine xenograft models, which will not only enable the quick and safe transplantation of cells but also serial analyses of the bone marrow.

Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. ...

Femur Fensterkammer Modell für

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Automatisierte Quantifizierung Hämatopoetische Zell - Stromal Cell Interactions in histologische Bilder unentkalkte Knochen

Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren

Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten

Oberschenkelknochenmark-Aspiration im Live-Mäuse

Murine Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection und Knochenmark-Isolation

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

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Automatisierte Quantifizierung Hämatopoetische Zell - Stromal Cell Interactions in histologische Bilder unentkalkte Knochen

Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren

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In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

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