Diese Arbeit wird durch einen Zuschuss von RO1 NIH (NINDS) unterstützt.

1. Vorbereitung Viren zur Injektion <ol><li> rAAVs wurden von den empfohlenen kommerziellen Anbieter erworben, aber sie können auch in der eigenen Labor hergestellt werden (siehe Diskussion unten). Das Virus ist in der Regel bei einem Titer von ~ 1x10 12 Genom Kopien pro Milliliter (GC / ml) hergestellt und kann bei voller Titer verwendet werden, um eine große Anzahl von Zellen zu manipulieren. Alternativ können sie verdünnt, um das gewünschte Maß an spärliche Beschriftung zu erzeugen. Die entsprechende Verdünnung muss vom Anwender bestimmt werden, aber eine 1:10-Verdünnung wird empfohlen, um zu starten. </li><li> Thaw Viren auf Eis unmittelbar vor dem Gebrauch. Übertragen Sie die gewünschten Vorverdünnung Volumen von Virus-Lösung in eine kleine (~ 250μl) PCR-Röhrchen. Verdünnen Sie die Virus-Lösung mit einem geeigneten Volumen sterilen DPBS in einer Gewebekultur Kapuze. Shop verdünnten Virus-Lösung auf Eis, bis es gebraucht wird. </li></ol> HINWEIS: Abwicklung aller Viren im Einklang mit einem Biosafety-Protokoll von Ihrer Einrichtung genehmigt durchgeführt werden 2. Spritze Be-und Gerätemontage <ol><li> Verbinden Sie den Laden Nadel auf das Glas Spritze und ziehen Sie den Virus-Lösung aus der PCR-Röhrchen durch leichtes Ziehen Sie den Kolben. Ziehen Sie den Kolben, bis eine sehr kleine Luftblase in der Spritze sehen kann, das zeigt, dass die gesamte Lösung in die Spritze ist und nicht in den Laden der Nadel. Alternativ kann auch eine kleine Menge des inerten Farbstoffs an der Lösung zugegeben werden, um sichtbar zu machen. HINWEIS: Eine kleine PCR-Röhrchen sollen die Be-Nadel wird in der Regel nicht lange genug, um den unteren Rand der meisten anderen Rohren zu erreichen verwendet werden. </li><li> Entfernen Sie den Laden Nadel und legen Sie die Spritze auf die Spritze Block einer Spritzenpumpe, befestigen Sie sie mit der Spritze Halter. </li><li> Schieben Sie das eine Ende des Binde-Rohr in die Spritze, stecken Sie das andere Ende in den Nadelhalter. Legen Sie die Injektionsnadel in den Nadelhalter. Das Ende der Injektionsnadel sich direkt an das Ende der Binde-Rohr innerhalb des Nadelhalters. </li><li> Drücken Sie langsam den Kolben von Hand auf die Lösung durch die Binde-Rohr schieben. Drücken, bis ein kleiner Tropfen der Lösung sichtbar ist an der Spitze der Injektionsnadel. </li><li> Vorsichtig Position der Kolben neben dem Drücker-Block und sichern Sie ihn mit dem Schieber blockieren Halterung. </li><li> Setzen Sie die Injektion Parameter: Injektionsrate sollte etwa 8μl/min (~ 130nl / s) sein; Injektionsvolumen ist in der Regel 1-2UL; wählen Sie die entsprechende Spritze Durchmesser für die Spritze Größe, die Sie verwenden (siehe die Spritzenpumpe Handbuch für guidelines). </li><li> Stellen Sie die Kochplatte auf ~ 38 ° C und mit einem Papiertuch oder einem anderen dünnen Barriere für die Welpen während der Erholungsphase zu schützen. </li></ol> 3. Injektionsverfahren und pup Erholung <ol><li> Bereiten P0 oder P1 Maus Welpen zur Injektion, indem man sie kalt Anästhesie nach einem IACUC genehmigten Protokoll. Feuchten Sie ein paar Papiertücher mit Wasser und auf Eis stellen. Legen Sie die gewünschte Anzahl von Jungtieren (4-5) auf dem Papiertuch (damit sie auch getrennt) und vorsichtig unter das Papier Handtücher über die Welpen, damit sie von feuchten Papiertuch abgedeckt sind. Gently Ort eine kleine Menge crushed ice auf der Oberseite des Papierhandtücher und inkubieren Sie die Welpen für ca. 5 Minuten. Die Welpen können auf Eis gehalten werden bis zu 15 Minuten und wieder fein danach. </li><li> Nach der Welpe ist ausreichend narkotisiert, stellen Sie es auf einem Montageblock (wir verwenden einen Styropor-Block, hält in der Regel 15ml Tuben) und positionieren Sie es für die besten Zugriff auf die Injektionsstelle. Für die Rinde ist es am einfachsten, das Tier platt auf dem Bauch lag, während für das Kleinhirn ist es hilfreich, den Welpen den Kopf über den Rand des Blocks der Lage, einen besseren Zugang zu den hinteren Teil des Schädels bieten. Der Welpe kann anstelle mit einem Band-Aid gesichert werden, falls gewünscht. </li><li> Halten Sie die Welpen den Kopf in ihn mit einer Hand, während die Nadel manuell durch den Schädel an der gewünschten Stelle mit der anderen Hand eingefügt. Es ist hilfreich, ziehen die Haut straff, um es von Bewegung während der Injektion zu verhindern. Für die Rinde ist es sinnvoll, die Injektionen in Bezug auf eine klar definierte anatomische Wahrzeichen, wie die Lambda-Naht des Schädels zu machen, wie dies auch in Zukunft Injektionen helfen werden. Das Kleinhirn kann durch den Schädel als ein dünner Streifen liegende Gewebe direkt kaudal des Colliculus gesehen werden. Die Tiefe, in der die Nadel eingeführt werden sollte variiert leicht zwischen den einzelnen Tieren und Stämme und kann durch vorher festgelegte Markierungen auf der Nadel gemessen werden, jedoch für Kortex und Kleinhirn finden wir, dass in einer Tiefe von ~ 0,5 - 1 mm von der Oberfläche in der Regel geeignet ist. Die Eintauchtiefe für andere Websites sollten experimentell durch den Endverbraucher bestimmt werden. HINWEIS: Die Nadel sollte leicht durchdringen den Schädel, wenn es nicht tut, NICHT zu hart, da dies das Tier verletzen kann. Positionieren Sie die Nadel und sanft wieder zu versuchen. </li><li> Spritzen Sie die Virus-Lösung. Die Injektion wird gestarteted durch Drücken der START-Taste an der Pumpe oder deprimierend ein Fußpedal, je nach dem Vorbild der Injektor verwendet. In Abwesenheit von einem Fußpedal ist es empfehlenswert, eine Kollegin mit Drücken der Taste zu helfen, unnötige Handbewegungen, dass die Injektion beeinflussen können minimiert werden. </li><li> Nach der gewählten Lautstärke injiziert wurde, halten Sie die Nadel im Ort für ein paar Sekunden und dann entfernen Sie vorsichtig die Nadel, indem Sie sie glatt. Achten Sie darauf, den Welpen den Kopf in Position zu halten, um überflüssige Bewegungen zu minimieren. Da die Injektion Ausrüstung gereinigt und zwischen den Experimenten mit Ethanol sterilisiert und die Wunde klein ist, ist die Verwendung von antiseptischen überflüssig. </li><li> Platzieren Sie den Welpen auf der überdachten Heizplatte mit der eingestellten Temperatur bei ~ 38 ° C zu erwärmen für Erholung, in der Regel 5-10 Minuten. Während dieser Zeit können Sie weiterhin Injektion anderen Welpen. </li><li> Nach all der Welpen erholt haben (sollten sie rosa und Bewegung) nehmen einen Teil der Wohnung Bettwäsche und sanft einmassieren die Welpen mit. Bringen Sie den Welpen der Mutter als eine Gruppe. </li></ol> HINWEIS: Es ist sehr wichtig, um sicherzustellen, dass die Welpen sind warm und ausgesetzt zu Hause Betten vor Rückgabe an die Mutter und sie als Gruppe zurückzukehren. Andernfalls kann die Mutter verletzen oder zu töten die Jungen führen. 4. Reinigung der Geräte <ol><li> Nach der Injektion abgeschlossen ist und die Welpen haben ihre Mutter zurückgegeben worden, reinigen Sie die Injektion Setup durch vollständig laden Sie die Spritze mit Aceton oder 70% Ethanol. Spülen Sie die Lösung durch die Injektion Setup mehrmals mit frischen Lösung jeder Zeit. Damit entfernen Sie alle verbleibenden Virus-Lösung und fällt aus. Das Aceton oder Ethanol wird dann verdampft. HINWEIS: Aceton ist für die Reinigung bevorzugt, aber wenn Ihr Setup nutzt jede Aceton-empfindlichen Bauteilen, wie Cyanacrylat-Klebstoffe, dann 70% Ethanol für diese Schritte. </li><li> Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit Bleichmittel und entsorgen Abfälle in einen geeigneten Behälter für biologischen. </li></ol> 5. Analyse <ol><li> Sacrifice die Tiere in der gewünschten Zeit mit einem IACUC genehmigt Euthanasie-Methode. Perfusionsfixierung wird empfohlen, in späteren Visualisierung der infizierten Nervenzellen, insbesondere bei erwachsenen Tieren zu helfen. </li><li> Standard-Immunfärbung Verfahren können verwendet werden, um das Fluoreszenzsignal zu verstärken. Kurz gesagt, sind 100 pm schwimmenden Vibratom Abschnitte mit PBS +1% Triton X-100 permeabilisiert und blockiert in PBS +1% Triton X-100 +10% normalem Ziegenserum. Die Profile werden in Blocking-Lösung mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 ° C, durch zusätzliche Wasch-und Blockierung gefolgt inkubiert. Abschnitte werden dann in Blocking-Lösung mit Sekundärantikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, gründlich gewaschen, montiert auf Dias und eingedeckt mit anti-fade Montage Medien. Kryoschnitte kann auch verwendet werden, um markierten Neuronen sichtbar zu machen, aber die endogene Fluoreszenz verloren gehen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Eine erfolgreiche Injektionsverfahren wird robust Infektion von Neuronen im Bereich der Injektionsstelle ohne erkennbare Gewebeschädigung oder anderen negativen Auswirkungen auf das Tier zu erzeugen. Wie in Abbildung 1 dargestellt, kann die Ausbreitung der Infektion in Cre-Reporter-Mäuse (ROSA26R) 12 mit rAAV8-Cre in verschiedenen anatomischen Stellen injiziert beobachtet werden. Injektionen in bestimmten Regionen, wie Rinde und Colliculus superior, erzeugen typischerweise lokale Infektionen mit minimaler Ausbreitung auf angrenzende Regionen (Abb. 1A-B). Die Nutzung des High-Titer-Virus-Lösung macht Infektion von benachbarten Gebieten, wie dem Hippocampus, desto wahrscheinlicher (Abb. 1A). Injection mit niedrigem Titer-Virus-Lösung führt zu spärlich Infektion, die in der Regel bleibt in der Nähe der Injektionsstelle, wie im Kleinhirn Injektion von rAAV8-Cre in der Mittellinie des ROSA26R Reporter-Mäuse (Abbildung 1C-D) gezeigt. Wir haben Rekombination in ROSA26R Reporter Mäusen innerhalb von 2 Tagen nach der Injektion von rAAV8-Cre, was darauf hindeutet, dass eine Infektion, Rekombination und Expression von Reporter-Gene lassen sich alle relativ schnell erfolgen. Darüber hinaus haben wir erfolgreich diese Technik verwendet, um die Auswirkungen von Gen-Deletion an einem nicht-ROSA Locus mit einem floxed bedingte Allel Studie werden die Ergebnisse, die an anderer Stelle veröffentlicht werden. Die Anzahl der Zellen infiziert sind, sollten mit dem Titer der injizierten viralen Lösung korrelieren. Zum Beispiel, Einspritzen einer Mischung aus hohen Titer Lösungen aus zwei rAAV8 Viren, die verschiedene fluoreszierende Proteine ​​in das Kleinhirn befällt viele Purkinjezellen, die unterschiedlich beschriftet sind (Abb. 2A). Umgekehrt kann Einspritzen einer geringen Titer-Virus-Lösung in spärlich Infektion bei der Visualisierung einzelner Zellen (Abb. 2B) Beihilfen führen. Fluoreszenzmarkierten Neuronen können direkt in frischen Schnittblumen, lebendes Gewebe (Abb. 2B) beobachtet werden können oder zu Immunfärbung auf die endogene Fluoreszenz-Signale für die spätere Bildaufnahme von wide-field oder Co zu verbessern unterzogen werdennfocal Fluoreszenz-Mikroskopie (Abb. 2A, Abb.. 3A-C). Schließlich ist rAAV8 infizieren kann eine Vielzahl von Neuronen-Typen in der Hirnrinde mit starken Kennzeichnung von feinen Prozesse (Abb. 3A-C). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" /> Abbildung 1: LacZ Färbung im Gehirn von ROSA26R Reporter Mäusen, die mit rAAV8-Cre bei P0 injiziert wurden demonstriert Cre-Aktivität und die Lage der Infektion. <ol type="A"><li> Weitwinkel-sagittal Ansicht eines P14 Gehirn, die hohe Titer (1x10 12 GC / ml) Injektionen in Kortex und Colliculus superior. Der Einsatz von High-Titer-Virus macht es wahrscheinlicher, dass benachbarte Bereiche auch infiziert werden. </li><li> Sagittalschnitt P14 Kortex mit niedrigeren Titer (1x10 11 GC / ml) injiziert Virus zeigt eine lokale Infektion mit weniger verbreitet. </li><li> Ein wholemount Ansicht eines P28 Kleinhirn an der Mittellinie mit niedrigen Titer (1x10 9 GC / ml)-Virus-Lösung injiziert zeigt, dass die Infektion spärlich ist und bleibt typischerweise in der Nähe der Injektionsstelle. </li><li> Sagittal Ansicht der Mittellinie des Kleinhirns in C). Beachten Sie, dass in der Regel nur Purkinje Zellen durch rAAV8 infiziert sind. </li></ol><img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" /> Abbildung 2: Kleinhirn Kennzeichnung durch Injektion mit hohem und niedrigem Titer von rAAV8 Ausdruck fluoreszierende Proteine. <ol type="A"><li> Ein Sagittalschnitt der P21cerebellum mit einer Mischung aus beiden Viren Ausdruck EGFP (grün) und DsRed (rot) infiziert. Ein hoher Titer Mischung von Viren verwendet wurde, um eine große Anzahl von Purkinje-Zellen zu infizieren. </li><li> Eine Purkinje-Zelle in Live-P14 Kleinhirn von einem sehr niedrigen Titer Virusinfektion abgebildet sofort nach der Sektion. </li></ol><img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" /> Abbildung 3: Kortikale Kennzeichnung von rAAV8-DsRed. Beispiele für die Vielfalt der kortikalen Neuronen-Typen in der koronalen Abschnitte eines P21 Kortex, um P0 rAAV8-DsRed infiziert war.

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L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Neugeborenen-viralen Injektion hier vorgestellte Methode bietet einen einfachen und schnellen Weg, um in vivo Mosaiken für das Studium der postnatalen Entwicklung des Gehirns zu erzeugen. Die Methode nutzt floxed Allele, die derzeit verfügbar sind sowie diejenigen, die über den High-Throughput-Gene Targeting Projekt 6 vorgenommen werden. Verglichen mit dem Einsatz von transgenen Expression von Cre, bietet diese Methode einen schnellen Weg, um Genfunktionen in verschiedenen Zelltypen Test, wie ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> rAAV8-Cre,-GFP, DsRed-, </td><td> Vector Biolabs </td><td> # 7060, # 7061, kundenspezifischen Auftrag </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> Harvard Pump 11 Plus </td><td> Harvard Apparatus </td><td> # 702208 </td><td> (Keine Fußpedal-Port) </td></tr><tr><td> Retinalen Pigmentepithels Injection Kit </td><td> World Precision Instruments </td><td> RPE-KIT </td><td> Enthält Binde-Schläuche, Kanülen (36G) und Nadelhalter </td></tr><tr><td> Nanofil Spritze, 100 &amp;mgr; </td><td> World Precision Instruments </td><td> NANOFIL-100 </td><td> Beinhaltet wiederverwendbare loading Nadel </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> GFP-Antikörper </td><td> Aves </td><td> GFP-1020 </td><td></td></tr><tr><td> DsRed antibody </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> Heizblock </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R Maus </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination

Normale Funktion des Gehirns beruht nicht nur auf der Embryonalentwicklung, wenn wichtige Nervenbahnen etabliert sind, sondern auch auf die postnatale Entwicklung bei neuronalen Schaltkreisen gereift und verfeinert. Fehlregulation in diesem Stadium können zu neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen wie Autismus und Schizophrenie 1,2 führen. Viele Gene sind in der pränatalen Gehirn untersucht und festgestellt, von entscheidender Bedeutung für viele Entwicklungsprozesse 3-5. Allerdings ist ihre Funktion in der postnatalen Gehirn weitgehend unbekannt, teils weil ihre Deletion in Mäusen führt oft zu Letalität bei Neugeborenen Entwicklung, teils weil ihre Forderung in der frühen Entwicklung behindert die postnatale Analyse. Um diese Hindernisse zu überwinden, sind floxed Allele dieser Gene derzeit in Mäusen 6 erzeugt. Wenn mit transgenen Allele, die ausdrückliche Cre-Rekombinase in bestimmten Zelltypen, bedingte Löschung erreicht werden, um Genfunktionen in der postnatalen Gehirn studieren können kombiniert werden. Allerdings erfordert diese Methode zusätzliche Allele und zusätzliche Zeit (3-6 Monate), um die Mäuse mit den entsprechenden Genotypen zu erzeugen, wodurch die Expansion der genetischen Analyse, um im großen Maßstab im Gehirn der Maus. Hier zeigen wir einen komplementären Ansatz, dass viral-Ausdruck Cre verwendet, um diese floxed Allele schnell und systematisch zu untersuchen in der postnatalen Entwicklung des Gehirns. Durch Einspritzen von rekombinanten Adeno-assoziierte Viren (rAAVs) 7,8 Kodierung Cre in der neonatalen Gehirn, sind wir in der Lage, das Gen von Interesse in verschiedenen Regionen des Gehirns zu löschen. Durch die Steuerung der virale Titer und Koexpression ein fluoreszierendes Protein-Marker, können wir gleichzeitig zu erreichen Mosaik Gen-Inaktivierung und spärliche neuronale Kennzeichnung. Diese Methode umgeht die Forderung vieler Gene in der frühen Entwicklung, und erlaubt uns, ihre Zelle selbst eine autonome Funktion in vielen kritischen Prozesse in der postnatalen Entwicklung des Gehirns, einschließlich axonalen und dendritischen Wachstums-Studie, Verzweigungen und Fliesen, sowie Synapsenbildung und Raffinesse. Diese Methode wurde bereits erfolgreich in unserem eigenen Labor (unveröffentlichte Ergebnisse) und andere 8,9 verwendet, und kann auch auf andere Viren, wie Lentivirus 9, sowie die Expression von shRNA oder dominant aktive Proteine ​​10 verlängert werden. Darüber hinaus durch die Kombination dieser Technik mit der Elektrophysiologie sowie kürzlich entwickelten optischen Imaging-Tools 11, bietet diese Methode eine neue Strategie zu untersuchen, wie genetische Signalwege neuronalen Schaltkreis Entwicklung und Funktion in Mäusen und Ratten beeinflussen.

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Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Methode, um Genfunktionen in postnatalen Gehirn-Test beschrieben. Rekombinante AAV Ausdruck Cre und / oder ein fluoreszierendes Protein werden in neonatalen Gehirn der Maus injiziert. Mosaic Gen-Inaktivierung und spärliche neuronale Markierung erreicht, die eine schnelle Analyse der Genfunktion in kritischen Prozesse auf neuronale Schaltkreis Entwicklung.

Mosaic Analyse der Genfunktion in Postnatale Mäusehirnen mithilfe von Virus-basierten Cre Rekombination

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

mosaic-analysis-gene-function-postnatal-mouse-brain-development-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Aufrufe.  Keck School of Medicine, University of Southern California. Ein In vivo Methode, um Genfunktionen in postnatalen Gehirn-Test beschrieben. Rekombinante AAV Ausdruck Cre und / oder ein fluoreszierendes Protein werden in neonatalen Gehirn der Maus injiziert. Mosaic Gen-Inaktivierung und spärliche neuronale Markierung erreicht, die eine schnelle Analyse der Genfunktion in kritischen Prozesse auf neuronale Schaltkreis Entwicklung.

Serie: Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

Gene Lieferung in Postnatale Rattengehirn von Non-ventrikuläre Plasmid Injektion und Elektroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Forschung

Neurowissenschaften

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

In ovo Elektroporation in Mittelhirn-Küken für Studien über Genfunktion in dopaminergen Neuronen Entwicklung

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Homochronic Transplantation von Interneuron Vorstufen in frühen postnatalen Mäusegehirnen

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

Studium der Funktion des Gehirns bei Kindern mit Magnetoenzephalographie

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

Produktion, Reinigung und Qualitätskontrolle für Adeno-assoziierten Virus-basierte Vektoren

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Chronische Implantation des gesamten kortikalen Electrocorticographic Arrays in der Weißbüschelaffe

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Transplantation von chemogenetisch hergestellten kortikalen Interneureuren in frühpostnatale Maushirne

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...