Die American Cancer Society (MRSG-08-108 bis 01), Vincent J. Sgro / The American Brain Tumor Association, und der Khan Family Foundation denn ich Nakano.

1. Vorbereitung der Medien <ol><li> Die Medien wurden unter Verwendung von 10% FBS (16140-071 - GIBCO) in DMEM/F-12 (1X), Liquid 1:1 (10565-042 - Invitrogen) mit 0,6% Agar-Lösung gereinigt, granuliert (1.01614.1000-EMD ). Sterile Bedingungen waren während des gesamten Versuchs beibehalten. </li><li> Für die Herstellung von Medien 5mL der FBS (16140-071 - GIBCO) wurde 45ml DMEM/F-12 (1X) hinzu, Liquid 1:1 (10565-042 - Invitrogen) machen Endvolumen von 50 mL. Die vorbereiteten Medien wurde im Wasserbad bei 37 ° C Temperatur gehalten. </li><li> Die Agar-Lösung wurde hergestellt unter Verwendung von Wärme Mikrowellen-Methode. 0,3 Gramm Kristallzucker Agar wurde in 50 mL destilliertem Wasser mit Mikrowelle aufgelöst. Die Agar-Lösung wurde abgekühlt auf 37 ° C Temperatur, indem sie es in das Wasserbad. </li><li> Wir haben gleiches Volumen von Medien aus Schritt 1,2 und 1,3 und bereitete Stammlösung. Das Verhältnis von 0,6% Agar (0,5 ml) und 10% FBS-D-MEM/F-12 Medien (0,5 ml) wurde 1:1, so dass das Gesamtvolumen von 1 ml in jedes Well der 6-Well-Platten. </li></ol> 2. Tissue Verarbeitung <ol><li> Glioblastoma multiforme (GBM) Gewebe wurden sofort nach der Operation von Department of Pathology erhalten. Das Gewebe wurde als GBM vom Department of Pathology eingestuft. </li><li> Das Gewebe wurde auf patri-Platte mit einer Pinzette vorsichtig überführt und mit eiskaltem 5mL 1XPBS für 3-fache. </li><li> Serielle Teile der Proben wurden aus dem seziert Proben geschnitten, um Tumor-Blöcke (ca. 10 mm im Durchmesser) mit einem Skalpell (Feather-2976 # 10) und ForceP (Fisher Scientific) zu schaffen. </li><li> Die Blöcke wurden in einer 6-Well-Platte übertragen. Jedes Well wurde mit 1ml von Medien in Schritt 1.4 zu nennen. Das Gewebe hatte genug an der Luft zu halten Gewebe lebensfähig. </li><li> Tumor-Blöcke wurden dann entweder mit DMSO (5%) oder TMZ (2,5 nM) injiziert und inkubiert 16 Stunden bei 37 ° C in angefeuchteter Luft mit 5% CO2. 0,1 ml DMSO (5%) oder TMZ wurde 3-mal in der Tumor-Blöcke injiziert an verschiedenen Orten für die konsequente Behandlung. Das Medikament injiziert wurde, mit Insulinspritze 1ml 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Comfort Point-26027). </li><li> Nach 16 Stunden Blöcke wurden mit 5 ml 1XPBS für 3-mal gewaschen. Nach dem Waschen der Blöcke wurden mit 10 ml 10% v / v Formalin für 24 Stunden (Ricca Chemical Company) in 50 ml-Röhrchen (Basix-5539802) fixiert und für die in Paraffin eingebetteten 4 &amp;mgr; m Abschnitte. </li><li> Die Formalin-fixierten Abschnitt wurde in Becherglas auf der Rührplatte mit &quot;Keine Wärme&quot; platziert und bearbeitet durch die folgenden Lösungen für 30 Minuten in jeder Lösung. 30% Ethanol, 50% Ethanol, 75% Ethanol, 80% Ethanol, 95% Ethanol, 100% Ethanol und Xylol. </li><li> Das Gewebe wurde auf Küchenpapier abgetupft und in geschmolzenem Paraffin (58 bis 60 ° C, Fisher Paraplast Paraffin) für 30 Minuten. </li><li> Das Gewebe in Formen mit Surgipath Blue Ribbon Paraffin eingebettet war, wurde eingebetteten Gewebe auf Raumtemperatur abgekühlt. </li><li> Paraffin eingebettete Gewebeschnitte wurden 4 &amp;mgr; m entnommen und auf Fisher Plus-Objektträger. </li></ol> 3. Immunhistochemie Die Immunhistochemie wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. 1 <ol><li> Entparaffinierung und Rehydrierung Objektträger in ein Rack, und führen Sie folgende Schritte aus. Xylol für 3x5 Minuten (3-mal für 5 Minuten), 100% Ethanol für 3x5 Minuten, 95% Ethanol für 1x5 Minuten, 70% Ethanol für 1x5 Minuten in fließendem Leitungswasser für 3 Minuten ausspülen. </li><li> Antigen-Retrieval mit Wärme induzierte Epitopdemaskierungslösung Tauchen Dias in 1X Citratpuffer (Thermo Scientific-AP9003-500) in destilliertem Wasser in ein Becherglas verdünnt. Kochen für 15 Minuten auf einer Heizplatte (stellen Sie sicher, Abschnitte don &quot;t fallen aus der Folie). Die Lösung wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Folien mit 1X PBS für 3x5 Minuten. </li><li> Die Hemmung der internen Peroxid Tauchen die Folien in Methanol (Fisher Scientific-A-452 bis 4) mit 0,3% Wasserstoffperoxid (Fisher in destilliertem Wasser Scientific-BP2633-500-verdünnt) in einem Becherglas 15 Minuten lang. Spülen in 1X PBS für 3x5 Minuten. </li><li> Blocking Abdeckung des Gewebes mit 10% normalem Ziegenserum. Die Objektträger in einer feuchten Box und inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Folien mit 1X PBS für 3x5 Minuten. </li><li> Menschen spezifische Caspase-3 (1:1000, R &amp; D Systems, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626) mit 1X PBS verdünnt: Primäre Antikörper Schnitte wurden über Nacht bei 4 ° C mit dem Primärantikörper bei folgenden Konzentrationen inkubiert. Spülen Sie die Folien in 1X PBS 3x10 Minuten auf den nächsten Tag. </li><li> Sekundäre Antikörper-Reaktion Abdeckung des Gewebes mit 2-3 Tropfen HRP markierten sekundären Antikörper (vorstellen Systeme). Legen Sie Folien in einer feuchten Box und inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Waschen mit 1X PBS für 3x10 Minuten. </li><li> Spurensuche für die Chromogen DAB-Kit (Vector Laboratories-SK-4100) Entwicklung für die Erkennung von primären Antikörper nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Gegenfärbung Tauchen Sie die Dias mit Hämatoxylin (10-15 s<html> econds, stellen Sie sicher, don &quot;t überrannt DAB-Signal). Spülung mit fließendem Leitungswasser für 3 Minuten. </li><li> Dehydration Tauchen Sie die Folien in folgender Reihenfolge, 70% Ethanol für 5 Minuten, 95% Ethanol für 5 Minuten, 100% Ethanol für 3x5 Minuten, Xylol für 3x5 Minuten. </li><li> Deckglas die Folien mit permount Montage-Reagenz (Fisher Scientific-SP-15 bis 100). </li><li> Bilder wurden mit Olympus-Fluoreszenzmikroskop (DP-72) .3.11). In allen Experimenten wurde spezifische Markierung durch die Negativ-Kontrolle ohne Primärantikörper bestätigt. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Wir sammelten chirurgischen Proben des Glioblastoma multiforme (GBM). Die Patienten erhielten eine der ersten Operation ohne vorherige Chemotherapien einschließlich Temozolomid (TMZ). Die T1-gewichteten Bild der MRT mit Gadolinium Enhancement in Abbildung 1a gezeigt-eine verbesserte Tumor im rechten Stirnlappen vor der Operation. Die postoperative Bild (Abb. 1b) bestätigt subtotale Entfernung der Läsion nach der Operation. Die chirurgische Gewebe wurden an das Department of Pathology für die klinische Diagnose Zweck geschickt, und die restlichen Exemplare wurden an die Gewebeentnahme im Rahmen des genehmigten Institutional Review Board (IRB)-Protokoll an der Ohio State University Medical Center verarbeitet. Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E)-Färbung zeigte die Anwesenheit von Nekrosen, pseudopallisading Zellen und mikrovaskuläre Proliferation (Abb. 1-c). So wurden diese Tumoren histopathologisch als GBM diagnostiziert. Zu beachten ist, erhalten Tumor Explantate nach Inkubation ohne TMZ bis zu 48 Stunden der Zytoarchitektur der GBM. Im Gegensatz dazu mit Inkubation für 72 Stunden oder länger, wir die erhöhte Anzahl der kondensierten Kerne in den Proben festgestellt, was darauf hindeutet einige der Tumorzellen beginnen, Apoptose. Als Ergebnis enthielt Tumorgewebe nach längerer Inkubationszeit lückenhaft Regionen, die Tumorzellen, die bevorzugt in und um Nekrosen (Daten nicht gezeigt) beobachtet wurden verloren. Um zu untersuchen, ob dieser Tumor Explantation Proben zuverlässig für die Zwecke der Wirksamkeit von Medikamenten testen genutzt werden, testeten wir die Wirkung des TMZ-Behandlung. Abbildung-2 stellt den Ablauf der Experimente in dieser Studie. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass intratumorale Injektion von TMZ stärker auf das Wachstum auswirken Kontrolle von malignen Gliomen ist als die der systemischen Verabreichung dieses Medikaments 2. Nach Inkubation für 16 Stunden wurden diese Explantate mit Paraffin-und serielle Schnitte wurden für die Färbung vorbereitet eingebettet. Immunhistochemie von TMZ behandelten GBM Gewebe zeigte eine erhebliche Reduzierung der Ki-67-positive Tumorzellen im Vergleich mit den Kontrollproben. Im Gegenzug hat die Immunhistochemie mit einem Apoptose-Marker, Caspase-3, keine signifikanten Unterschiede zwischen TMZ behandelt Gliom Proben und die Kontrollproben (Abbildung-3). Treatment-Effekt mit TMZ wurde durch die Kombination dieser Explantation Ansatz zusammen mit entweder in vitro-Kultur oder Durchflusszytometrie charakterisiert. Genauer gesagt, haben wir versucht, die Auswirkungen auf die Stammzellen-like Tumorzellen (SCLTC) zu bestimmen. Daher folgende intratumoralen Behandlung mit TMZ, führten wir Kugel-Assay und Durchflusszytometrie dieser Tumor Explantate. Die TMZ behandelten Proben wurden dissoziiert in einzelne Einzelzellen und diese einzelnen Zellen wurden in einer geringen Dichte ausgesät (1 Zelle pro Mikroliter oder weniger) in 96-Well-Platten in serum-freiem Medium mit bFGF und EGF ergänzt. In der Kontrollgruppe wurde die Bildung von Tumor-Kugeln aus dem Tumor Explantate nach 7 Tagen Inkubation beobachtet. Da die Kugel Bildung einer Eigenschaft SCLTC 3 4 ist, zeigt Änderungen in der Zahl der Tumor-Kugeln durch eine medikamentöse Behandlung die Wirkung auf SCLTC. Ebenso wurde der Durchflusszytometrie der dissoziierten Tumor Explantate mit einem Zelloberflächenmarker, CD133, aus der Wirkung auf SCLTC verifizieren. Wenn SCLTC in heterogenen Tumorzellen in GBM selektiv durch eine medikamentöse Behandlung beseitigt werden, könnte man sagen voraus, dass die Durchflusszytometrie sollten Abnahme des CD133-positive Fraktion durch Behandlung (Daten nicht gezeigt) zu erkennen. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Figure.1 Kernspintomographien (MRI) eines Patienten GBM. Representative Zahlen von vor der Operation Bild-1a und nach der Operation Bild-1b. Figure-1c ist H &amp; E Färbung von frischen GBM Gewebeprobe. Original-Vergrößerung, 40X. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung. 2 Die experimentellen Strom von Block Kultur Experiment. Figure-2a. Bild von frischen chirurgischen GBM erhielt von der Pathologie. Figur-2b zeigt Dissection von Tumor-Block in 10mm kleine Stücke mit Hilfe chirurgischer Klinge. Figure-2c ist das Medikament (TMZ) Behandlung von Tumor-Blöcke mit Insulinspritze. e 3 &quot;/&gt; Abbildung. 3 Immunhistochemie. Immunhistochemie von GBM Gewebe Blöcke mit DMSO oder TMZ mit aktivierter Caspase-3 und Ki67 injiziert. Hämatoxylin wurde für die Kernfärbung verwendet. Original-Vergrößerung, 40X.

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Es besteht eine Kluft zwischen der Wirksamkeit von Medikamenten in der aktuellen präklinischen experimentellen Modelle und die Wirksamkeit bei Patienten. Genauer gesagt, in den Hirntumor Forschungsgebiet, sind neu und zuverlässige Methoden erforderlich, dass würde helfen, die Lücke zwischen dem Medikament Auswertung mit den aktuellen Methoden und die Wirksamkeit bei Patienten. Der beschriebene Test in dieser Studie ist ein zusätzlicher Vorteil, wenn nicht eine Lösung zu erleichtern füllen die Diskrepanz der experimentellen Daten und die Ergebnisse der betroffenen Patienten. In-vitro-Zellkulturen bevorzugt erweitern bestimmten Tumor Zelltypen unabhängig von den Kulturbedingungen und stellen nur eine Subpopulation der gesamte Tumor. 5 Darüber hinaus tritt genetische und phänotypische Umwandlung der künstlichen Zelle Expansion und ist mit dem langfristigen Zellkulturen unvermeidlich . Eine der wichtigsten Hürden zu malignem Gliom zu behandeln, ist die Heterogenität der Tumorzellen, sowohl innerhalb eines einzelnen Tumors und zwischen Tumorproben 6, 7. Daher selektiven Anreicherung von einer bestimmten Population von Tumorzellen, unabhängig von einen oder anderen Art, kann kein geeignetes Mittel, um die Wirksamkeit von Chemotherapeutika auf heterogenen Tumorzellen zu bestimmen. 8 9 Jede Tiermodell von Hirntumoren aus einer Subpopulation von abgeleiteten Tumorzellen vergossen Lichter an der Wirksamkeit von Arzneimitteln auf einer Subpopulation, aber nicht den gesamten Tumor. Mehrere Einschränkungen, auf der anderen Seite, noch in diesem Tumor Explantation Methode bleiben. Eine solche Einschränkung ist die relativ kurze Dauer der Behandlung. Da bösartige Tumorzellen betrachtet werden, Beständigkeit gegen die meisten zu erwerben, wenn nicht alle Therapien im Laufe der Zeit, erste Kontrolle des kurzfristigen Wachstums der Tumorzellen kann nicht durch die langfristige Prognose der Patienten berücksichtigt werden, wurde erst mit einem Anti-gemeldet Angiogenese-Medikament, Bevacizumab 10. So ist die Verbesserung des Protokolls für diesen Test zur Explantation Gewebe über einen längeren Zeitraum zu bewahren mit weiteren Untersuchungen erforderlich. Eine andere Frage ist eine spezifische Wirkung des getesteten Medikaments auf SCLTC in den Tumor. Da SCLTC relativ resistent gegenüber der aktuellen Therapien bei malignen Gliomen, die Identifizierung von neuartigen Anti-Krebs-Medikamente, die dabei wirksam beseitigen SCLTC gerechtfertigt ist sind. In diesem Zusammenhang haben wir derzeit versuchen, diese Explantat-Assay mit der anschließenden Kombination in vitro-Experimenten, wie Neurosphäre-Assay (Daten nicht gezeigt). Wir erwarten, dass mehr über die Auswirkungen zu lernen, wenn überhaupt, der ein Arzneimittelkandidat auf SCLTC durch diese kombinierte Tests. Schließlich kann die Verwendung von kleinen Blöcken von Tumorproben nicht den gesamten Tumor Zellpopulationen, wie es der Fall mit der konventionellen Tumor-Zelllinien oder primären Kulturen aus chirurgischen Proben. Diese Fragen beiseite, die Erhaltung Tumorstroma, einschließlich der vaskulären Nische, ist hilfreich bei der Charakterisierung der Umweltfaktoren für Tumorzellen. Daher kann dieser Test haben das Potenzial für eine therapeutische Strategien unter einer physiologisch relevanten Bedingungen zu evaluieren. Hier haben wir einen Test zur Wirksamkeit von Medikamenten-Tests mit Explantaten von chirurgischen Exemplare der GBM. In der Tat, mit der geprüft chirurgischen Proben fanden wir, dass eine direkte Injektion von TMZ Verbreitung in der GBM Proben reduziert. Dieses Gewebe Explantation Methode ist theoretisch auch für andere solide Tumoren und stellt Gewinn für Wirksamkeit von Medikamenten bei einem Patienten der Tumor, die hoffentlich helfen wird, uns zu vermeiden ein weiteres Scheitern in klinischen Studien für Krebserkrankungen zu bestimmen.

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum, Qualifizierte, hitzeinaktiviertem </td><td> GIBCO </td><td> 16140-071 </td></tr><tr><td> D-MEM/F-12 (1X) Liquid 01.01 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-042 </td></tr><tr><td> Agar-Agar Purified, granuliert </td><td> EMD </td><td> 1.01614.1000 </td></tr><tr><td> DPBS zur Färbung </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> Hematoxyllin </td><td> Richalrd allan sci </td><td> 7211 </td></tr><tr><td> 10% w / v Formalin Caspase-3 </td><td> Ricca Chemieunternehmen </td><td> 3810 </td></tr><tr><td> Caspase-3 </td><td> R &amp; D-Systemen </td><td> AF835 </td></tr><tr><td> Ki67 </td><td> Dako </td><td> 15626 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td></tr><tr><td> Envision System-Anti-Maus </td><td> Dako </td><td> 2012-07 </td></tr><tr><td> Envision System-Anti-Kaninchen </td><td> Dako </td><td> 2011-12 </td></tr><tr><td> DAB-kit </td><td> Vector Lab. </td><td> SK-4100 </td></tr></table> Tabelle 1. Materials. <table border="1"><tr><td> Bezeichnung des Geräts </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> 6-Well Platte </td><td> Greiner-Bio One </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Petrischale </td><td> VWR </td><td> 25384-302 </td></tr><tr><td> Serologische Pipette </td><td> Axygen </td><td></td></tr><tr><td> Filter tips </td><td> USA wissenschaftlichen </td><td></td></tr><tr><td> 500 pm Polyester-Mesh Netwell einfügen </td><td> Costar </td><td> 3480 </td></tr><tr><td> Matrigel Matrix </td><td> BD Biosciences </td><td> 354230 </td></tr><tr><td> BD 10 ml-Spritze </td><td> BD Biosciences </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Injektionsnadel Aluminum Hub. </td><td> Tyco Health Care </td><td> 2000029 </td></tr><tr><td> Zellkulturflasche </td><td> Corning </td><td></td></tr><tr><td> Zentrifugenröhrchen </td><td> Basix </td><td> 5539800 </td></tr><tr><td> Dünnwandige Rohre </td><td> Eton </td><td> 1107A </td></tr><tr><td> Chirurgische Klinge aus rostfreiem Stahl </td><td> Feder </td><td> 2976 # 10 </td></tr><tr><td> Insulinspritze </td><td> Comfort Punkt </td><td> 26027 </td></tr><tr><td> 50ml Flat-Top-Schraubverschluss Röhrchen </td><td> Basix </td><td> 5539802 </td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop </td><td> Tritech </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Olymp </td><td> DP-72 </td></tr><tr><td> Pinzette </td><td> Fisher Sci </td><td></td></tr></table> Tabelle 2. Equipment.

method for novel anti-cancer drug development using tumor explants of surgical specimens

Die derzeitigen Therapien bei malignen Gliomen haben nur palliative Wirkung. Für die therapeutische Entwicklung, ist eine Hürde die Diskrepanz der Wirksamkeit durch aktuelle Wirksamkeit von Medikamenten-Tests und die Wirksamkeit am Patienten bestimmt. Somit sind neue und zuverlässige Methoden zur Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln in der vorklinischen Phase gewährleistet. In-vitro-Kultur von Tumorgewebe, einschließlich Zelllinien, hat erhebliche phänotypische, genetischen und epigenetischen Veränderungen von Krebszellen durch künstliche Umgebung von Zellkultur verursacht, die nicht unbedingt die Biologie der ursprünglichen Tumoren in situ. Xenograft-Modellen mit der immundefizienten Mäusen haben auch Einschränkungen, dh das Fehlen von Immunsystem und Interspezies genetischen und epigenetischen Unterschiede in Mikroumgebung. Hier zeigen wir eine neue Methode mit der chirurgischen Proben von malignem Gliom undissoziierten Tumorblöcke auf die Behandlung Auswirkungen zu bewerten. Zur Validierung dieser Methode werden die Daten mit der aktuellen First-Line-Chemotherapeutikum Temozolomid (TMZ), beschrieben. Wir nutzten die frisch entfernt chirurgischen Exemplar malignem Gliom für unsere Experimente. Wir führten intratumorale Injektion von TMZ oder anderer Wirkstoffkandidaten durch Inkubation und Analysen über chirurgische Proben verfolgt. Hier haben wir versucht, ein Tumorgewebe Explantation Methode als eine Plattform, um die Wirksamkeit von neuartigen Krebstherapien bestimmen zu etablieren, so dass wir in der Lage zu überwinden, zumindest einige der derzeitigen Einschränkungen und füllen die Lücke zwischen der aktuellen experimentellen Daten und die Wirksamkeit auf einer tatsächlichen Patienten Tumor. Diese Methode kann das Potenzial haben, zu beschleunigen Identifizierung neuartiger Chemotherapeutika für feste Krebsbehandlung.

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Hier haben wir eine Methode zur Wirksamkeit von Medikamenten-Tests mit chirurgischen Proben von Hirntumoren, sogenannte &quot;Tumor-Explantat-Methode&quot;. Mit dieser Methode können wir Wirksamkeit von Medikamenten ohne die Mikroumgebung von soliden Tumoren zu bewerten. Zur Validierung Zuverlässigkeit dieser Methode beschreiben wir repräsentative Daten mit unseren Gliom Probe mit der gängigen First-Line Chemotherapeutikum Temozolomid behandelt.

Verfahren zur Novel Anti-Cancer Drug Development mit Tumor Explantate von chirurgischen Proben


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

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16.5K Aufrufe.  The Ohio State University Medical Center. Hier haben wir eine Methode zur Wirksamkeit von Medikamenten-Tests mit chirurgischen Proben von Hirntumoren, sogenannte "Tumor-Explantat-Methode". Mit dieser Methode können wir Wirksamkeit von Medikamenten ohne die Mikroumgebung von soliden Tumoren zu bewerten. Zur Validierung Zuverlässigkeit dieser Methode beschreiben wir repräsentative Daten mit unseren Gliom Probe mit der gängigen First-Line Chemotherapeutikum Temozolomid behandelt.

Serie: Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Verbessertes Protokoll für Laser Mikrodissektion Of Human Pankreasinseln Von chirurgischen Proben

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Forschung

Medizin

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal function of the light sensitive neurons, the photoreceptors. Detachment of the retina from the RPE creates a physical gap that is filled with extracellular fluid. RD initiates cellular and molecular adverse events that affect both the neurosensory retina and the RPE since the physiological exchange of ions and metabolites is severely perturbed. The consequence for vision is related to the duration of the detachment since a rapid reapposition of the two tissues results in the restoration of vision 1. The treatment of RD is exclusively surgical. Removal of vitreous gel (vitrectomy) is followed by the removal non essential part of the retina around the detached area to favor retinal detachment. The removed retinal specimens are res nullius (nothing) and consequently normally discarded. To recover RNA from these surgical specimens, we developed the procedure jouRNAl that allows RNA conservation during the transfer from the surgical block to the laboratory. We also standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for global gene expression analysis. The quality of the RNA was validated both by RT-PCR and microarray analysis. Analysis of the data shows a simultaneous involvement of inflammation and photoreceptor degeneration during RD.

We used retinal samples from retinectomy for a transcriptomic analysis of retinal detachment. We developed a procedure that allows RNA conservation between the surgical blocks and the laboratory. We standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for microarray analysis.

Transkriptom-Analyse der menschlichen Retina chirurgischen Proben mit Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Eine erschwingliche HIV-1 Drug Resistance Überwachungsmethode für Ressourcen Begrenzte Einstellungen

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to the development of metastatic disease in animal models and in cancer patients. Preclinical work from our group and others has demonstrated a profound suppression of innate immune function, specifically NK cells in the postoperative period and this plays a major role in the enhanced development of metastases following surgery. Relatively few animal studies and clinical trials have focused on characterizing and reversing the detrimental effects of cancer surgery. Using a rigorous animal model of spontaneously metastasizing tumors and surgical stress, the enhancement of cancer surgery on the development of lung metastases was demonstrated. In this model, 4T1 breast cancer cells are implanted in the mouse mammary fat pad. At day 14 post tumor implantation, a complete resection of the primary mammary tumor is performed in all animals. A subset of animals receives additional surgical stress in the form of an abdominal nephrectomy. At day 28, lung tumor nodules are quantified. When immunotherapy was given immediately preoperatively, a profound activation of immune cells which prevented the development of metastases following surgery was detected. While the 4T1 breast tumor surgery model allows for the simulation of the effects of abdominal surgical stress on tumor metastases, its applicability to other tumor types needs to be tested. The current challenge is to identify safe and promising immunotherapies in preclinical mouse models and to translate them into viable perioperative therapies to be given to cancer surgery patients to prevent the recurrence of metastatic disease.

A mouse tumor model of surgical stress is used to explore how postoperative immune suppression promotes metastatic disease and to evaluate immunostimulatory perioperative therapies.

Ein Maus-Tumormodell der operativen Belastung zu Entdecken Sie die Mechanismen der postoperative Immunsuppression und Bewerten Novel Perioperative Immuntherapien

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Verfahren zur Gewinnung von Primäreierstockkrebszellen von Solid Proben

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United States. Tacrolimus is a narrow therapeutic index drug and as such requires therapeutic drug monitoring and dose adjustment based on its whole blood trough concentrations. To facilitate home therapeutic drug and adherence monitoring, the collection of dried blood spots is an attractive concept. After a finger stick, the patient collects a blood drop on filter paper at home. After the blood is dried, it is mailed to the analytical laboratory where tacrolimus is quantified using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in combination with a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
For tacrolimus analysis, a 6-mm disc is punched from the saturated center of the blood spot. The blood spot is homogenized using a bullet blender and then proteins are precipitated with methanol/0.2 M ZnSO4 containing the internal standard D2,13C-tacrolimus. After vortexing and centrifugation, 100 &#181;l of supernatant is injected into an online extraction column and washed with 5 ml/min of 0.1 formic acid/acetonitrile (7:3, v:v) for 1 min. Hereafter, the switching valve is activated and the analytes are back-flushed onto the analytical column (and separated using a 0.1% formic acid/acetonitrile gradient). Tacrolimus is quantified in the positive multi reaction mode (MRM) using a tandem mass spectrometer.
The assay is linear from 1 to 50 ng/ml. Inter-assay variability (3.6%-6.1%) and accuracy (91.7%-101.6%) as assessed over 20 days meet acceptance criteria. Average extraction recovery is 95.5%. There are no relevant carry-over, matrix interferences and matrix effects. Tacrolimus is stable in dried blood spots at RT and at +4 &#176;C for 1 week. Extracted samples in the autosampler are stable at +4 &#176;C for at least 72 hr.

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

Die Quantifizierung des Immunsuppressivums Tacrolimus auf Getrocknetes Blut mittels LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

A Novel Murine Model of Arteriovenous Fistula Failure: The Surgical Procedure in Detail

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the exact pathophysiology remains unknown. In order to unravel the pathophysiology a murine model of AVF-failure was developed in which the configuration of the anastomosis resembles the preferred situation in the clinical setting. A model was described in which an AVF is created by connecting the venous end of the branch of the external jugular vein to the side of the common carotid artery using interrupted sutures. At a histological level, we observed progressive stenotic intimal lesions in the venous outflow tract that is also seen in failed human AVFs. Although this procedure can be technically challenging due to the small dimensions of the animal, we were able to achieve a surgical success rate of 97% after sufficient training. The key advantage of a murine model is the availability of transgenic animals. In view of the different proposed mechanisms that are responsible for AVF failure, disabling genes that might play a role in vascular remodeling can help us to unravel the complex pathophysiology of AVF failure.

Here we present a murine model of arteriovenous fistula (AVF) failure in which a clinically relevant anastomotic configuration is incorporated. This model can be used to study the pathophysiology and to test possible therapeutic interventions.

A Novel Mausmodell der arteriovenöse Fistel Ausfall: Der chirurgische Eingriff im Detail

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

Ein Hirntumor / Organotypischen Co-Kultursystem für die Untersuchung Tumor-Microenvironment und gezielte Arzneimitteltherapie

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.